Biologia delle cellule staminali

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1 Biologia delle cellule staminali come si IDENTIFICANO, si CATTURANO e si CRIOPRESERVANO Irene Paolucci Dirigente biologo Servizio Immunotrasfusionale Polo Ospedaliero di Verbania ASL VCO

2 le cellule staminali hanno ricevuto negli ultimi anni una sempre maggiore attenzione da parte della ricerca scientifica e dalla stampa per le loro potenzialità

3 Capacità di autorinnovamento Capacità di differenziarsi in progenitori commissionati Due tipi di cellule staminali: Staminali embrionali Staminali adulte

4 una cellula si divide (di solito raramente), dando origine a due cellule diverse fra loro : una cellula figlia uguale alla madre (staminale ) e una cellula figlia diversa (progenitore) che anche se può dividersi numerose volte ad un certo punto perderà la capacità di duplicarsi (STAMINALITA ) e la sua progenie si differenzierà in un solo tipo cellulare o in più tipi cellulari, sarà unipotente o multipotente

5 Nell uomo Le cellule staminali embrionali presenti nell embrioblasto, isolate e coltivate per la prima volta nel 1998, sono in grado di dare origine a tutti i tessuti differenziati dell organismo (neuroni, epatociti, cardiomiociti.. ). La prospettiva di rigenerazione dei tessuti danneggiati da malattie degenerative è diventato ampio oggetto di studio. le cellule staminali adulte sono presenti in molti e forse in tutti gli organi anche se il loro numero si riduce con l avanzare dell età. Anche il sistema nervoso centrale e periferico sembrano possedere le loro cellule staminali neurali stimolabili in vitro. A partire dal 1998 numerose pubblicazioni dimostravano la stupefacente capacità plastica delle cellule staminali embrionali e adulte : multipotenti a seconda dello stimolo cui erano sottoposte in vitro.

6 Cellula staminale emopoietica E una cellula presente nel midollo osseo e nel sangue periferico capace di: automantenersi dare origine a tutte le linee cellulari emopoietiche

7 LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (1) Negli anni 70 SI ERA NOTATO CHE ALCUNI GIORNI DOPO CHEMIOTERAPIA IL SANGUE PERIFERICO era INTERESSATO DA UNA 'FIAMMATA' DI CELLULE CLONOGENICHE 100 VOLTE PIU' FREQUENTI CHE IN CONDIZIONI BASALI. Intorno alla metà degli anni '80, CON L'AVVENTO DEI FATTORI DI CRESCITA EMOPOIETICI (EPO, G-CSF), USATI PER ACCELERARE LA RIPRESA EMOPOIETICA DOPO CHEMIOTERAPIA, QUESTA 'FIAMMATA' VENIVA GRANDEMENTE AMPLIFICATA (MOBILIZZAZIONE DI CELLULE CLONOGENICHE) VARIABILITA' DI COMPARSA (Picco 9-14 gg POST- CHEMIO), IN FUNZIONE DI VARIABILI CLINICHE.

8 LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (2) LE CELLULE DEL SANGUE PERIFERICO SONO ELEMENTI MATURI TERMINALI. TUTTAVIA, SE SI COLTIVA CON OPPORTUNI FATTORI DI CRESCITA UN QUALSIASI SANGUE PERIFERICO NORMALE, SI NOTA DOPO 15 gg LA COMPARSA DI COLONIE DI VARIO TIPO. QUESTO SIGNIFICA CHE IL SANGUE NORMALE E' INTERESSATO DALLA CIRCOLAZIONE DI ELEMENTI DOTATI DI CAPACITA' CLONOGENICA..

9 LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (3) SI E' QUINDI PENSATO DI TRARRE VANTAGGIO DA QUESTA FIAMMATA DI CELLULE CLONOGENICHE: IL SANGUE PERIFERICO PER POCHI GIORNI SI TRASFORMA IN UNA SPECIE DI MIDOLLO. SE PRELEVO CON LEUCAFERESI I GB CIRCOLANTI OTTENGO QUINDI FACILMENTE MOLTE CELLULE STAMINALI CHE POSSO UTILIZZARE PER SUPPORTARE NUOVI CICLI DI CHEMIOTERAPIA QUI NASCE LA NUOVA BRANCA DELLA CHEMIO- TERAPIA "AD ALTE DOSI": AUMENTA L'EFFICACIA DELLA TERAPIA SUI TUMORI CHEMIOSENSIBILI, GRAZIE AL SUPPORTO DELL' AUTOTRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI.

10 LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (4) IL PROBLEMA ERA QUELLO DI RICONOSCERE LE CELLULE STAMINALI IN TEMPO REALE. I TESTS CLONOGENICI DANNO RISPOSTE SOLO DOPO 15 GIORNI, NON SONO CONTROLLABILI E SONO CARATTERIZZATI DA ELEVATA VARIABILITA'.

11 FREQUENZA DELLE CELLULE STAMINALI CD34 MIDOLLO OSSEO: CONDIZIONI BASALI 1% STIMOLATO 5% SANGUE PERIFERICO CONDIZIONI BASALI 0.1% STIMOLATO 1% DA UN CORDONE OMBELICALE SI RICAVANO CIRCA x 105 cellule totali 70kg 70x10 5 QUINDI SI PREDILIGE L UTILIZZO DEI CORDONI PER I TMO PEDIATRICI

12 COME SI RICONOSCONO Domodossola 20 ottobre 2012

13 Nel 1984 scopre l antigene CD34 Prof. CURT I.CIVIN University of Maryland

14 Caratteristiche fenotipiche delle cellule staminali emopoietiche Nell uomo l antigene di superficie identificativo è ilcd34, glicoproteina integrale di membrana, pm pari a kda. Unico marcatore fenotipico delle cellule emopoietiche agli stadi primordiali La sua funzione biologica nell emopoiesi non è completamente chiarita : sembra coinvolta nei meccanismi di adesione e di homing midollare delle cellule staminali.

15 STEM CELL PHENOTYPE CD34++ AdH+ Rod 123 Fase S ± LINEAGE PHENOTYPE CD34+ Rod 123+ Fase S ++ CD90+ CD38 - CD45RA - CD62L - HLADR - CD90± CD38+ CD45RA+ HLADR+ CD62L+ CD117± CD 133 MINORANZA DI CELLULE FENOTIPO PIU' IMMATURO BASSA REPLICAZIONE MAGGIORANZA DI CELLULE FENOTIPO PIU' MATURO VARIETA' MARCATORI LINEA ALTA REPLICAZIONE

16 IL PROTOCOLLO MILANO (Siena, Bregni, Brando ) R2 R1 SEMPLICE TEST A SINGOLO COLORE (FITC), DOPPIA PIATTAFORMA APPLICABILE A TUTTI I CITOMETRI. NO GATE LOGICO ANCORA MOLTO USATO IN MOLTI CENTRI PUNTO DEBOLE: NON ELIMINA EFFICACEMENTE EVENTI ASPECIFICI SOVRASTIMA DELLE CD34+ A BASSO LIVELLO % e ASSOLUTO

17 INTERNATIONAL SOCIETY of HEMATOTHERAPY AND GRAFT ENGINEERING

18 IL CONTEGGIO DELLE CELLULE CD34+ MARCATURA CD45 FITC / CD34 PE (di Classe III) ACQUISIZIONE DI ALMENO 100 EVENTI CD34+ CONCENTRATIONE DEL CAMPIONE < /µl TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA (Microsfere) PIPETTAMENTO INVERSO DI PRECISIONE PROTOCOLLO ISHAGE CONTROLLI DI QUALITA ESTERNI (UK NEQAS)

19 CONTA IN SINGOLA PIATTAFORMA IL PRINCIPIO DELLE MICROBEADS Parameter 2 MICRO BIGLIE QUANTITà NOTA CELLULE QUANTITà IGNOTA VOLUME NOTO DI CAMPIONE GATE 1 (Cells) GATE 2 (Beads) Parameter 1 N of CELL Events (Gate 1) N of BEAD Events (Gate 2) X N of BEADS per ABSOLUTE Unit of Volume = CELL COUNT

20 LDS All LDS+ events R1 Gated on R1 R2 R7 R5 NOT Gated on R1*R2 Gated on R1*R2*R3 Lymphs from R5 R3 R4 R4 R6 BEADS THRESHOLD R8 Gate Events % Gated G1 (CD45) G G G4 (STEM G4 (stem CELLS) cells) G5 (Lymphocytes) G6 G6 (BEADS) G7 (acq. gate) R8: CELLS ONLY

21 METODO ROBUSTO E RIPRODUCIBILE LA RIGOROSA STRATEGIA DI GATING EVITA L' INCLUSIONE DI EVENTI MARCATI ASPECIFICAMENTE MOLTO PRECISO E ACCURATO ANCHE PER CONTE CD34+ % e /µl ESTREMAMENTE BASSE DIRETTAMENTE APPLICABILE A TECNICHE DI CONTEGGIO IN SINGOLA PIATTAFORMA (ISHAGE Modificato EWGCCA)

22 COME SI CATTURANO Domodossola 20 ottobre 2012

23 RACCOLTA CELLULE STAMINALI MIDOLLO ASPIRAZIONI MULTIPLE DALLA CRESTA ILIACA POSTERIORE IN ANESTESIA GENERALE/SPINALE. (cresta iliaca anteriore e sterno) IL MIDOLLO VIENE ASPIRATO, PROCESSATO E QUINDI CRIOPRESERVATO O SUBITO REINFUSO

24 RACCOLTA DI CELLULE STAMINALI DA MIDOLLO OSSEO

25 RACCOLTA CELLULE STAMINALI SANGUE PERIFERICO La raccolta di cellule staminali da sangue periferico avviene tramite passaggio del sangue in una macchina che e in grado di identificare le cellule staminali e di trattenerle, restituendo tutte le altre cellule al paziente. Le cellule staminali cosi raccolte vengono concentrate e criopreservate o subito reinfuse.

26 .. e che era possibile raccogliere un numero sufficiente di queste cellule con procedure di leucoaferesi La somministrazione di G-CSF per 3-4 giorni determina un incremento significativo delle CD34 circolanti da 3,8 x 10 9 /l a 61,9 x 10 9 /l pari ad un incremento di 16,3 volte del loro basale. La raccolta di cellule staminali avviene attraverso il passaggio di sangue in una macchina che è in grado di trattenere le CSE e restituire tutte la altre cellule al paziente/donatore (Korbling et al, 1995)

27 GB /µl Chemioterapia Conta CD34+ GB CD 34+ /µl Trattamento con G-CSF Giorni DECISIONE DI EFFETTUARE LEUCAFERESI ESEMPIO SCHEMATICO Procedura Di Mobilizzazione E Raccolta CD34+ AB cd 1 AB cd 2 AB cd 3 CONTA ASSOLUTA Cellule CD34+ RACCOLTE IN CIASCUNA SACCA Valutazione Finale Raccolta Cellule CD34+/Kg Peso

28 REPARTO CLINICO (Ematologia, Oncologia...) Identifica il Paziente Candidabile e Pone Indicazione al TX. Decide START e STOP Procedure LABORATORIO FCM Monitorizza il Livello di CD34+ Durante la Mobilizzazione. Misura Quantità CD34+ e Qualità della Raccolta. Misura i Parametri Post-Aferesi. Valuta Qualità dello Scongelato al Momento del TX. SERVIZIO IMMUNO- TRASFUSIONALE Valuta Eleggibilità Paziente al Trattamento Aferetico. Esegue Aferesi. Manipola, Campiona, Custodisce e Assegna la Sacca di Aferesi

29 Dal cordone ombelicale di tanti piccoli donatori

30 Come si criopreservano Le cellule umane e animali possono essere criopreservate in azoto liquido a -196 C per almeno 15 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche. Il mantenimento di tali caratteristiche biologiche oltre i 15 anni non ha al momento nessuna prova scientifica. Si verifica una minima riduzione della loro capacità clonogenica. Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento Domodossola 20 ottobre 2012

31 Tanto tempo fa. Le origini della criobiologia risalgono al 2500 a.c. quando gli Egiziani già utilizzavano le basse temperaturee in medicina. L'uso del freddo era consigliato da Ippocrate come un ottimo rimedio contro i sanguinamenti e i gonfiori. Agli albori dello sviluppo della medicina moderna, Robert Boyle studiò gli effetti delle basse temperature sugli animali. Nel 1949 un gruppo di scienziati guidati da S. Polge sottopose per la prima volta dello sperma a un processo di crioconservazione. Oggigiorno la stessa tecnica è applicata in innumerevoli altri campi: il congelamento di organi e tessuti è un'operazione di routine.

32 Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche (CSE)-1 CSE vitali per 2-3 giorni a temperature > a t. di congelamento

33 Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche (CSE)-2 Possibili danni della crioconservazione: Cristalli di ghiaccio e danno degli organuli cellulari Cristalli di ghiaccio extracellulari e disidratazione delle cellule Funzionamento parziale degli enzimi cellulari a basse Temperature con possibile accumulo di metaboliti tossici intermedi

34 Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche (CSE)-3 Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule Gli agenti crioprotettivi possono essere Dimetilsulfossido (DMSO) o Glicerolo; proteggono le cellule dai danni indotti dalla formazione dei cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento in una quantità pari al 5-10% della quota di sangue midollare da congelare

35 Il crioprotettore Principi base: DMSO aggiunto all anticoagulante pochi ml alla volta mentre viene raffreddato su ghiaccio (reazione esotermica) La lunga esposizione a temperatura ambiente al DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule (tempi ridotti per la preparazione delle aliquote da congelare) Controllo della velocità di raffreddamento

36 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa, la cellula è esposta a [ ] crescenti di soluti cellulari dovute alla formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione ALTA [ ] SOLUTI DISIDRATAZIONE VARIAZIONI DI ph > PRESSIONE OSMOTICA

37 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo alta, si avrà la formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che all interno della cellula DANNO MECCANICO CRISTALLI INTERNI CRISTALLI ESTERNI DISTRUZIONE DELLA MEMBRANA CELLULARE

38 ESISTE LA VELOCITA IDEALE? Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio! Il raffreddamento deve essere nello stesso tempo rapido in modo tale da non danneggiare la cellula per disidratazione! OTTIMIZZAZIONE DELLA VELOCITA NEL VALORE DI -1 C/MINUTO

39 Prima di congelare è necessario. Determinazione delle Cellule CD34 nella sacca Applicazione della Metodica in Citometria a Flusso Determina il valore assoluto delle cellule CD34+ (0,1-0,5%) che risulta di vitale importanza ai fini trapiantologici. Determinazione emocromo per cellularità della sacca da congelare

40 In pratica.. Preparazione della soluzione crioprotettiva Essa è costituita da: 10% ACD, anticoagulante 10% di Dimetilsulfossido, l agente crioprotettivo. Si aggiunge alla sacca da congelare una quota di soluzione crioprotettiva pari al 20% del volume finale da congelare

41 Fase congelamento Si inserisce la sacca da congelare nel Congelatore Programmabile 1 C/min -25 C -100 C 5-10 C/min Trasferimento in Tanica Criogenica

42 Il congelamento programmato Passaggio di stato

43 LA CONSERVAZIONE A lungo termine a -196 C, a -80 C per brevi periodi

44 LA FASE DI SCONGELAMENTO (1) I danni cellulari possibili durante la fase di scongelamento sono causati dal fenomeno della ricristallizzazione e per lo shock da diluizione dovuto alla fusione dei cristalli di ghiaccio con conseguente ipotonicità del liquido extracellulare. Ciò provoca il rigonfiamento delle cellule fino alla lisi Lo scongelamento rapido protegge da questi possibili problemi.

45 LA FASE DI SCONGELAMENTO (2) IN CONDIZIONI DI MASSIMA STERILITA! Ricordiamoci che il paziente è in aplasia midollare!! Scongelamento delle sacche a bagno maria sterile (37-38 C) nel più breve tempo possibile. Reinfusione solitamente attraverso catetere venoso centrale

46 A QUESTO PUNTO LE NOSTRE STAMINALI COSA FANNO?? Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche Con il termine Homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero nicchia nel midollo osseo.

47 HOMING (un altro aspetto essenziale della cellula staminale ) Circa il 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la nicchia midollare dell ospite! La nicchia midollare si può definire come una microstruttura spaziale nella quale alloggiano le CSE, che interagendo, con stimoli esterni, vanno incontro ad autorinnovamento santuario della staminalità La percentuale è leggermente variabile e correla con lo stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate; L attecchimento è massimo in cellule quiescienti ( le cellule possono perdere temporaneamente l antigene CD34)

48 L esito dell homing e la sua efficienza influenzano il successo dell attecchimento di un trapianto Domodossola 20 ottobre 2012

49 Grazie per l attenzione