Manuale Investigator Quantiplex

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1 Ottobre 2012 Manuale Investigator Quantiplex Per la quantificazione del DNA umano in campioni forensi Sample & Assay Technologies

2 Tecnologie per campioni e analisi QIAGEN QIAGEN è il leader mondiale nelle tecnologie per campioni e analisi destinate all estrazione e alla purificazione di acidi nucleici a partire da qualsiasi campione biologico. I nostri prodotti e i nostri servizi di alta qualità sono una garanzia di successo, dall analisi del campione al risultato. QIAGEN definisce gli standard: nella purificazione del DNA, RNA e delle proteine nell analisi di acidi nucleici e proteine nella ricerca sul microrna e sull RNAi nelle tecnologie automatizzate per campioni e analisi Il nostro obiettivo è il vostro successo. Per ulteriori informazioni, visitate il sito

3 Contenuto Contenuto del kit 4 Conservazione 4 Uso previsto 4 Informazioni di sicurezza 4 Introduzione 6 Principio e procedimento 6 Descrizione dei protocolli 10 Materiali e dispositivi addizionali richiesti 11 Note importanti 12 Selezione dei kit e dei protocolli 12 Rischi di contaminazione 12 Controlli 12 Protocolli Quantificazione del DNA utilizzando il Rotor-Gene Q 14 Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 35 Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification 47 Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR 61 Interpretazione dei risultati 73 Guida alla risoluzione dei problemi 76 Riferimenti bibliografici 80 Informazioni per gli ordini 81 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012 3

4 Contenuto del kit Investigator Quantiplex Kit (200) Catalogo n Numero di reazioni da 25 µl 200 Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) 2 x 1,15 ml Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) DNA di controllo Z1 (Control DNA Z1) (20 ng/µl) QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect ) 2 x 1,15 ml 0,2 ml 1 fiala Manuale 1 Conservazione Conservare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) e il DNA di controllo Z1 fra 2 e 8 C. Evitare di congelare questi componenti del kit. Conservare il QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) a 20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. La Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) deve essere conservata al riparo dalla luce. I campioni di DNA devono essere conservati separatamente dai reagenti per PCR. In queste condizioni, i componenti sono stabili fino alla data di scadenza riportata sul kit. Uso previsto Il kit Investigator Quantiplex è destinato ad applicazioni di biologia molecolare nelle analisi di medicina legale, identificazione umana e paternità. Il presente prodotto non è destinato alla diagnosi, alla prevenzione o al trattamento di malattie. Prestare la massima attenzione durante la manipolazione dei prodotti. Consigliamo a tutti gli utenti dei prodotti QIAGEN di attenersi alle Linee Guida NIH, redatte per gli esperimenti con DNA ricombinante, o ad altre linee guida applicabili. Informazioni di sicurezza Quando si opera con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi. Per ulteriori informazioni, consultare le relative schede di sicurezza sul prodotto (SDS). Le schede SDS, nel pratico e compatto formato PDF, sono disponibili online all indirizzo 4 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

5 Qui è possibile trovare, visualizzare e stampare la scheda MSDS per ciascun kit QIAGEN e i relativi componenti. Informazioni di emergenza 24 ore su 24 È possibile ottenere informazioni mediche di emergenza in inglese, francese e tedesco, 24 ore su 24, presso: Centro di informazioni antiveleni, Magonza, Germania. Tel: Manuale Investigator Quantiplex 10/2012 5

6 Introduzione L identificazione umana si basa di norma sull analisi di corte sequenze ripetute in tandem (STR), polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o polimorfismi insertion/deletion (DIP), in base ai requisiti di esame o alla qualità del campione. Questi test in multiplex utilizzati per l identificazione umana sono sistemi complessi che richiedono una gamma definita di template. Il kit Investigator Quantiplex è stato sviluppato per la quantificazione del DNA genomico umano in un campione utilizzando l analisi quantitativa PCR in tempo reale. Il kit è studiato per confermare se un campione contiene una sufficiente quantità di DNA per consentire l analisi fingerprinting del DNA (ad esempio analisi STR, DIP o SNP) e anche per stabilire se un campione contiene inibitori che possano interferire con tali applicazioni, richiedendo pertanto un ulteriore purificazione del campione. Principio e procedimento Il kit Investigator Quantiplex è un sistema pronto per l uso per il rilevamento del DNA umano mediante PCR. Il kit Investigator Quantiplex consente una rapida e precisa quantificazione del DNA umano in campioni di casistiche e database forensi. Il test presenta una sensibilità inferiore a 1 pg/µl, con una quantificazione precisa inferiore a 4,9 pg/µl, dove la curva standard mostra linearità. Il kit contiene reagenti e una DNA polimerasi per l amplificazione specifica di una regione proprietaria da 146 bp presente su diversi autosomi del genoma umano (in attesa di brevetto), e per il rilevamento dei prodotti PCR specifici sui sistemi Rotor-Gene Q o Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. La regione bersaglio di quantificazione è stata selezionata per offrire elevata sensibilità ed elevata affidabilità fra diversi individui e popolazioni. Questa regione bersaglio è stata convalidata in uno studio esterno da parte di numerosi laboratori forensi, in cui è stata analizzata la conservazione del suo numero di copie nella popolazione umana. È stata eseguita un analisi quantitativa PCR in tempo reale per confrontare una specifica singola copia umana e il bersaglio in multicopia Investigator Quantiplex. Il Delta-C T per i due bersagli è risultato confrontabile in diverse popolazioni e fra campioni di DNA maschili e femminili, il che dimostra la conservazione del numero di copie del bersaglio fra gruppi di diverso sesso e diversa etnia. La regione bersaglio di quantificazione viene rilevata utilizzando il canale verde sul T Rotor-Gene Q o il canale del colorante FAM sugli strumenti Applied Biosystems. Inoltre, il kit Investigator Quantiplex include un controllo interno di amplificazione bilanciato, che viene usato per testare l avvenuta amplificazione e rilevare eventuali inibitori della PCR. Questo sistema di amplificazione eterologo viene rilevato come un controllo interno (IC) da 200 bp nel canale giallo sul Rotor-Gene Q o nel canale del colorante VIC sugli strumenti Applied Biosystems. 6 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

7 Il rilevamento dell amplificazione viene effettuato utilizzando primer Scorpions e un innovativa, rapida chimica della PCR. I primer Scorpions sono molecole bifunzionali contenenti un primer PCR in legame covalente con una sonda (Figura 1). Il fluorocromo in questa sonda interagisce con un quencher, pure integrato nella sonda, che riduce la fluorescenza. Durante la PCR, quando la sonda si lega ai prodotti PCR, il fluorocromo e il quencher si separano. Ciò comporta un aumento della fluorescenza nella provetta di reazione. Sonda Fluorocromo Quencher Bloccante PCR Sonda Sonda Sonda DNA polimerasi Sonda Sonda Sonda Sonda Figura 1. Primer Scorpions e relativa funzione. I primer Scorpions sono ben noti per la loro rapida ibridizzazione alla sequenza bersaglio tramite reazione intramolecolare (Whitcombe, 1999). La chimica di reazione è stata attentamente ottimizzata per favorire una rapida attività. Manuale Investigator Quantiplex 10/2012 7

8 Controllo interno Il controllo interno (IC) è amplificato e rilevato nel canale giallo sul Rotor-Gene Q o nel canale del colorante VIC sugli strumenti Applied Biosystems. Il fluorocromo può essere rilevato con la calibrazione VIC esistente. L IC è studiato per essere più sensibile verso gli inibitori rispetto al bersaglio umano di quantificazione. Il confronto fra il valore C T del sistema IC per gli standard di DNA e il valore C T del sistema IC per campioni sconosciuti può fornire un indicazione di una potenziale inibizione della reazione nei campioni sconosciuti. Pertanto, anche nel caso in cui il sistema IC dimostri la presenza di inibitori nel campione, la quantificazione del DNA produce di norma un risultato affidabile. La presenza di inibitori nel campione può influenzare l applicazione a valle, pertanto occorre tenerne conto. L amplificazione positiva del sistema IC genera un valore C T pari a circa 31*. È prevedibile una variazione di ±1 nei valori C T del sistema IC per i campioni della curva standard. L impiego di ingenti quantità di DNA umano (>150 ng/reazione) può produrre un valore C T superiore per il sistema IC. Si raccomanda di eseguire una convalida di laboratorio con importanti inibitori per stabilire i criteri di rilevamento dell inibizione. Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) La Reaction Mix FQ (Miscela di reazione) FQ contiene una DNA polimerasi dalla formula straordinaria e un tampone di reazione. L innovativa chimica della PCR e l enzima, messi a punto specificatamente per l identificazione umana, consentono un elevata sensibilità e velocità. L enzima dalla nuova formula e la miscela del tampone di reazione sono ideali per supportare la rapida reazione dei primer Scorpions. Inoltre, il tampone PCR appositamente sviluppato contiene l additivo Q-Bond, che consente brevi tempi ciclo sui termociclatori standard e sui termociclatori rapidi con rapida velocità di ramping. Q-Bond aumenta l affinità della DNA polimerasi per il DNA a filamento singolo, riducendo a pochi secondi il tempo necessario per l annealing primer/sonda. Inoltre, la straordinaria composizione del tampone supporta il comportamento di fusione del DNA, consentendo brevi tempi di denaturazione e annealing/estensione. La Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) si basa inoltre sull eccezionale sistema tampone QIAGEN PCR. Il tampone contiene una combinazione bilanciata di KCl e NH 4 Cl, che favorisce un elevato rapporto del legame fra primer specifici e non specifici durante la fase di annealing di ogni ciclo PCR. Ciò crea stringenti condizioni di annealing dei primer, producendo un aumentata specificità della PCR. * Questo valore può variare a seconda dello strumento utilizzato. 8 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

9 DNA di controllo e curva standard Gli standard di quantificazione del DNA sono fondamentali per un analisi accurata. Si raccomanda vivamente di utilizzare serie di diluizioni di quattro volte con 7 punti di concentrazione nella curva standard per ogni test. Per garantire la precisione di pipettaggio, il volume iniziale minimo di DNA per le diluizioni deve essere di 10 µl. La curva standard è studiata per essere facilmente creata con una pratica serie di diluizioni 1:4. Se si utilizza l eccezionale QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) per diluire il DNA di controllo Z1, le diluizioni sono stabili per almeno 1 settimana ad una temperatura fra 2 e 8 C. IMPORTANTE: Il DNA di controllo Z1 è ottimizzato esclusivamente per l uso con il kit Investigator Quantiplex. Template per il lavoro di routine Per facilitare la configurazione dello strumento e l analisi dei risultati sul Rotor- Gene Q, sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification e sul sistema 7500 Fast Real-Time PCR, QIAGEN ha messo a punto una serie di file template. Questi template possono essere scaricati dal tab Resources (Risorse) nel sito Manuale Investigator Quantiplex 10/2012 9

10 Tabella 1. File template disponibili per il Rotor-Gene Q File template Investigator Quantiplex Kit Cycling (Ciclo del kit Investigator Quantiplex) Investigator Quantiplex Kit Sample (Campione del kit Investigator Quantiplex) Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel (Impostazioni di analisi del kit Investigator Quantiplex per il canale giallo) Scopo Preimpostazione del protocollo del ciclo Nome del campione, tipo di campione e concentrazione per la curva standard e il controllo interno Impostazioni del C T Descrizione dei protocolli In questo manuale vengono forniti i protocolli per quattro diversi termociclatori. Rotor-Gene Q Sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification Sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR 10 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

11 Materiali e dispositivi addizionali richiesti Quando si opera con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi. Per maggiori informazioni, consultare le relative schede di sicurezza (MSDS), reperibili presso il fornitore. Pipette e puntali per pipette Materiali di consumo privi di nucleasi (RNasi/DNasi): è richiesta particolare attenzione per evitare la contaminazione da nucleasi di tutti i reagenti e materiali di consumo utilizzati per preparare la PCR per il rilevamento sensibile del DNA umano Dispositivo refrigerante o ghiaccio Termociclatore in tempo reale (Rotor-Gene Q, sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification o sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR) Provette o piastre per PCR (utilizzare provette a parete sottile o piastre per PCR raccomandate dal produttore del proprio termociclatore) Per il Rotor-Gene Q: si consigliano provette per strisce e tappi, 0,1 ml (cat. n o ) o il Rotor-Disc 72 (cat. n o ). Si possono utilizzare anche provette per PCR, 0,2 ml (cat. n o ). Manuale Investigator Quantiplex 10/

12 Note importanti Selezione dei kit e dei protocolli Il presente manuale contiene protocolli e raccomandazioni per la quantificazione del DNA con gli strumenti elencati nella Tabella 2. I termociclatori in tempo reale diversi da quelli elencati non sono stati convalidati da QIAGEN per la quantificazione del DNA con il kit Investigator Quantiplex. Nota: È possibile anche una preparazione automatizzata. I protocolli Q convalidati per QIAgility sono disponibili gratuitamente nel tab User Support (Supporto utente) nel sito Tabella 2. Protocolli per il kit Investigator Quantiplex con diversi termociclatori in tempo reale Termociclatore in tempo reale Protocollo Rotor-Gene Q Pagina 14 Sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Pagina 35 Sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification Page 47 Sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Pagina 61 Rischi di contaminazione Rimuovere il sigillo dalle piastre di reazione solo quando l amplificazione è completa. Rimuovendo il sigillo dalle piastre si aumenta il rischio di contaminare successive reazioni con il prodotto amplificato. Tutte le miscele di reazione devono essere preparate in un area separata da quella utilizzata per l isolamento del DNA e l analisi dei prodotti PCR (post-pcr) per ridurre al minimo il potenziale rischio di cross-contaminazione. Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per ridurre al minimo una possibile crosscontaminazione. Controlli Controllo no template (NTC) Occorre includere replicati di reazioni NTC in ogni processo di quantificazione per rilevare eventuali casi di contaminazione. Gli NTC devono contenere tutti i componenti della reazione, ad eccezione dello stampo. La quantificazione 12 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

13 eseguita con il kit Investigator Quantiplex è altamente sensibile; osservare assoluta cautela per evitare casi di contaminazione durante il pipettaggio dell NTC. Consigliamo di eseguire le reazioni NTC almeno in duplicato. Controllo positivo interno Un controllo positivo interno (rilevato utilizzando un secondo primer Scorpions con una diversa etichetta) viene utilizzato per testare se l amplificazione è avvenuta con successo e per verificare la presenza di inibitori della PCR. Primer, primer Scorpions e template per il controllo interno sono tutti inclusi nella Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ). Manuale Investigator Quantiplex 10/

14 Protocollo: quantificazione del DNA utilizzando il Rotor-Gene Q Questo protocollo è ottimizzato per l uso del kit Investigator Quantiplex sul Rotor-Gene Q. Punti importanti prima di iniziare Preparare tutte le miscele di reazione in un area separata da quella utilizzata per l isolamento del DNA e per l analisi dei prodotti PCR (post- PCR). Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per ridurre al minimo una possibile cross-contaminazione. Utilizzare sempre le condizioni del ciclo specificate nel protocollo. Il ciclo è ottimizzato per questo test. Utilizzare sempre il volume di stampo specificato nel protocollo. La reazione è ottimizzata per l uso con 2 µl di DNA stampo. Non utilizzare una quantità superiore o inferiore a 2 µl per una reazione da 25 µl. Consigliamo di utilizzare un rotore a 72 pozzetti. Le diluizioni degli standard di quantificazione del DNA nel QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) possono essere conservate a 4 C per almeno 1 settimana. Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Prima di iniziare Scaricare i file template Investigator Quantiplex Kit Cycling file, Investigator Quantiplex Kit Sample file e Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel file. Cliccare sul tab Resources (Risorse) nel sito per scaricare i file. 14 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

15 Procedura 1. Scongelare il DNA di controllo Z1 e il QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect). Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare il DNA di controllo Z1 a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). 2. Preparare diluizioni seriali fresche del DNA di controllo Z1 come da Tabella 3. Agitare su vortex per almeno 5 s e centrifugare brevemente ogni soluzione prima di rimuovere un aliquota per la diluizione successiva. Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni diluizione. Fare attenzione ad evitare casi di cross-contaminazione. Tabella 3. Diluizioni seriali del DNA di controllo Z1 Diluizione seriale del DNA di controllo Z1 DNA di controllo Z1 Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect 20 ng/µl DNA non diluito 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) e gli acidi nucleici stampo. Miscelare la provetta capovolgendola diverse volte. Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) e la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). Manuale Investigator Quantiplex 10/

16 4. Preparare una miscela master come da Tabella 4. La miscela master contiene tutti i componenti necessari per la PCR, ad eccezione del DNA stampo (campione) e dell acqua priva di nucleasi. Preparare un volume di miscela master superiore del 10% a quello necessario per il numero complessivo di test PCR da eseguire. La miscela deve includere reazioni di controllo positive e negative. La reazione può essere di norma preparata a temperatura ambiente (15 25 C). Tuttavia, si consiglia di conservare i reagenti, i campioni e i controlli su ghiaccio oppure in un dispositivo refrigerante. Tabella 4. Miscela master per la quantificazione del DNA Componente Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), 2,18x Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ), 2,18x Volume totale della miscela master Volume per reazione da 25 µl Concentrazione finale 11,5 µl 1x 11,5 µl 1x 23 µl 5. Miscelare accuratamente la miscela master e dispensarne 23 µl nelle provette per strisce Rotor-Gene Q o nel Rotor-Disc Aggiungere 2 µl di QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) alle provette NTC. Accertarsi che le provette NTC non vengano a contatto con il DNA umano. 7. Aggiungere 2 µl di diluizioni del DNA di controllo o 2 µl di DNA di campioni sconosciuti alle singole provette per PCR e miscelare accuratamente. È molto importante miscelare attentamente per evitare concentrazioni localizzate di sale e DNA. La Tabella 5 mostra una possibile configurazione delle piastre. Accertarsi che la miscela master e lo stampo vengano accuratamente miscelati. È necessario inserire in ogni test e in ogni piastra di reazione duplicati delle diluizioni del DNA di controllo. 16 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

17 Tabella 5. Possibile configurazione delle piastre di reazione sul Rotor- Gene Q Contenuto dei pozzetti , UNK 25 UNK 33 UNK 41 UNK 49 UNK 57 UNK 65 UNK , UNK 26 UNK 34 UNK 42 UNK 50 UNK 58 UNK 66 UNK , UNK 27 UNK 35 UNK 43 UNK 51 UNK 59 UNK 67 UNK , UNK 28 UNK 36 UNK 44 UNK 52 UNK 60 UNK 68 UNK 5 1, , UNK 29 UNK 37 UNK 45 UNK 53 UNK 61 UNK 69 UNK 6 1, , UNK 30 UNK 38 UNK 46 UNK 54 UNK 62 UNK 70 UNK 7 0, NTC 23 UNK 31 UNK 39 UNK 47 UNK 55 UNK 63 UNK 71 UNK 8 0, NTC 24 UNK 32 UNK 40 UNK 48 UNK 56 UNK 64 UNK 72 UNK Tutte le quantità sono indicate in ng/µl. UNK: campione sconosciuto. 8. Chiudere le provette per PCR, collocarle nel rotore a 72 pozzetti nel termociclatore Rotor-Gene Q e inserire l anello di bloccaggio. Se si prevedono meno di 72 reazioni, le posizioni vuote nel rotore a 72 pozzetti devono essere riempite con provette per PCR vuote. 9. Aprire il software del Rotor-Gene. Nella procedura guidata avanzata, selezionare Open A Template In Another Folder (Aprire uno stampo in un altra cartella...) e caricare il file Investigator Quantiplex Kit Cycling file (File del ciclo del kit Investigator Quantiplex). Per impostare manualmente il ciclo, selezionare il profilo del ciclo Two Step (Due fasi) e cliccare su New (Nuovo). Consigliamo di utilizzare il file template fornito (vedere pag. 14 su come scaricare il file) per facilitare la preparazione della reazione. Manuale Investigator Quantiplex 10/

18 Procedura guidata avanzata del software Rotor-Gene. 10. Selezionare 72-Well Rotor (Rotore a 72 pozzetti) e confermare che l anello di bloccaggio è inserito spuntando la relativa casella di controllo. Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Conferma che l anello di bloccaggio è inserito. 18 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

19 11. Accertarsi che il volume di reazione sia pari a 25 µl e che la casella di controllo Apply Ambient Air Correction (Applica correzione dell aria ambiente) sia spuntata. Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Nota: La funzione Apply Ambient Air Correction non è disponibile in tutte le versioni del software. Se il software che si utilizza non la prevede, cliccare semplicemente su Next (Avanti) per continuare. Inserire il volume di reazione e spuntare la casella Apply Ambient Air Correction (Applica correzione aria ambiente), se il software prevede questa funzione. 12. Cliccare su Edit Profile (Modifica profilo) e programmare il termociclatore Rotor-Gene come da Tabella 6. Vedere anche le figure a pag. 20 e 21. L acquisizione dei dati va effettuata durante la fase di annealing/estensione combinata. Manuale Investigator Quantiplex 10/

20 Tabella 6. Condizioni del ciclo per il Rotor-Gene Q Fase Fase di attivazione della PCR iniziale Temp. Tempo Numero di cicli Commenti aggiuntivi 95 C 1 min La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi Ciclo a due fasi: Denaturazione Annealing / estensione combinate 95 C 60 C 1 s 10 s 40 cicli Effettuare una raccolta dei dati di fluorescenza utilizzando i canali verde e giallo con ottimizzazione del gain automatico Fase di attivazione della PCR iniziale. La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi. 20 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

21 Ciclo a due fasi. La PCR richiede 40 cicli. Ogni ciclo comprende 2 fasi: 1 s a 95 C (fase di denaturazione) e 10 s a 60 C (fase di annealing/estensione). 13. Per regolare le impostazioni di ottimizzazione del gain per i canali verde e giallo, selezionare innanzi tutto il canale verde, quindi cliccare su Gain Optimisation (Ottimizzazione gain) e poi su Optimise Acquiring (Ottimizza acquisizione). Nella finestra di dialogo che si apre confermare le impostazioni standard per entrambi i canali. Cliccare poi su OK. 14. Spuntare la casella Perform Optimisation Before 1st Acquisition (Esegui ottimizzazione prima della 1 acquisizione), quindi cliccare su Close (Chiudi). Accertarsi che la provetta in posizione 1 non sia vuota, poiché l ottimizzazione del gain viene eseguita su questa provetta. Manuale Investigator Quantiplex 10/

22 Funzione Gain optimization (Ottimizzazione del gain). Funzione Optimize acquisition (Ottimizza acquisizione). 22 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

23 Conferma delle impostazioni di ottimizzazione del gain per il canale verde. Conferma delle impostazioni di ottimizzazione del gain per il canale giallo. 15. Cliccare su Next (Avanti) per confermare il profilo di temperatura e la configurazione dei canali e verificare che i parametri siano corretti. Riepilogo dei parametri. Manuale Investigator Quantiplex 10/

24 16. Avviare il termociclatore Rotor-Gene cliccando su Start run (Avvia processo). Il sistema invita ad inserire il nome di un file e a salvare il file di esecuzione. 17. Dopo l avvio del processo, è possibile inserire un nome e una descrizione per ogni reazione mentre si attende la fine del processo. Se si utilizza la configurazione delle piastre consigliata nella Tabella 5, è possibile utilizzare anche l Investigator Quantiplex Kit Sample file (vedere pag. 14 su come scaricare il file). Per caricare il file template, cliccare su Open (Apri) e selezionare il file template richiesto. Un esempio di file template è illustrato qui di seguito. File template per modificare la curva standard. 24 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

25 Analisi dei dati Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Procedura 1. Aprire il file di esecuzione utilizzando il software del Rotor-Gene Q. Cliccare su File, poi su Open (Apri) e dopo ancora su Browse (Cerca) per localizzare il file salvato. 2. Occorre innanzi tutto definire gli standard prima di poter creare una curva standard. Se gli standard sono stati definiti prima dell inizio del processo, passare alla fase 10. Se si utilizza la configurazione delle piastre consigliata nella Tabella 5, è possibile anche importare il nome e il tipo di campione, nonché la concentrazione degli standard utilizzando direttamente l Investigator Quantiplex Kit Sample file. Consigliamo di utilizzare quel file per semplificare la preparazione della reazione. Vedere pagina 14 per le informazioni da scaricare. 3. Selezionare lo strumento Edit Samples (Modifica campioni) cliccando su Samples (Campioni). Strumento Edit Samples (Modifica campioni) nel software del Rotor-Gene Q. Manuale Investigator Quantiplex 10/

26 4. L Investigator Quantiplex Kit Sample file può essere scaricato cliccando su Open (Apri) e scegliendo il file. File template per modificare la curva standard. 5. Se il file template non è caricato, utilizzare il menu a tendina per definire il tipo di campione in ciascun pozzetto, ad es. Standard per gli standard di DNA e NTC per i controlli no template. Modifica dei campioni nel software del Rotor-Gene Q. 26 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

27 6. Nella colonna Given Conc. (Conc. data), inserire la concentrazione del DNA dello standard e definire l unità di misura (ng/µl) scegliendola nel menu a tendina. Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). Modifica delle unità di misura nel software del Rotor-Gene Q. 7. Creare una nuova pagina cliccando su New (Nuovo) e selezionando Synchronize pages (Sincronizza pagine). Lasciare tutti i campioni contrassegnati come Unknown (Sconosciuto) nella colonna Type (Tipo). Manuale Investigator Quantiplex 10/

28 Creazione di una nuova pagina campioni. 8. Aprire il menu More Options (Altre opzioni) e definire i criteri di applicabilità della pagina campioni. Selezionare l opzione Only display this sample page when analyzing data (Visualizza questa pagina campioni solo durante l analisi dei dati). Criteri di applicabilità della pagina campioni. 28 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

29 9. Selezionare il canale verde per la pagina 1 e il canale giallo per la pagina 2. Cliccare su Save and Close (Salva e chiudi). Chiudere la finestra Sample Page Suitabilities (Criteri di applicabilità pagina campioni) cliccando su Close (Chiudi). Selezione dei canali del colore. 10. Cliccare su OK nel tab Edit Samples (Modifica campioni). 11. Per analizzare i campioni, aprire lo strumento di analisi cliccando su Analysis (Analisi). 12. Nel tab Quantitation (Quantificazione), selezionare Page 1 (Pagina 1) per il canale verde e cliccare su Show (Mostra). Selezionare Page 2 (Pagina 2) per il canale giallo e cliccare su Show (Mostra). Se si apre automaticamente la finestra "Autofind Threshold" (Trova soglia automaticamente), cliccare su Cancel (Annulla). Manuale Investigator Quantiplex 10/

30 I grafici di amplificazione sia per il canale verde che per il canale giallo vengono visualizzati nella finestra Quantitation Analysis (Analisi di quantificazione). Tab Quantitation (Quantificazione) nello strumento Analysis (Analisi). 30 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

31 13. Attivare lo strumento Slope Correction (Correzione pendenza) per il canale verde. Strumento Slope correction (Correzione pendenza). 14. Selezionare i campioni nella tabella a destra. In fondo allo schermo a destra selezionare Auto-Find threshold (Trova soglia automaticamente) per il canale verde. I valori C T sono riportati nella finestra Quantitation Results (Risultati di quantificazione). L impostazione del valore soglia adeguato può richiedere un ulteriore convalida interna presso il laboratorio. Impostazione del valore C T per il canale verde utilizzando Auto-Find Threshold (Trova soglia automaticamente). Manuale Investigator Quantiplex 10/

32 15. Per il canale giallo importare le impostazioni dall Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel file utilizzando la funzione Import (Importa) in fondo allo schermo. Vedere pag. 14 su come scaricare questo file. In alternativa, selezionare un valore soglia C T di 0,05 e ignorare i primi 15 cicli. I valori C T sono riportati nella finestra Quantitation Results (Risultati di quantificazione). L impostazione del valore soglia adeguato può richiedere un ulteriore convalida interna presso il laboratorio. Impostazione del valore C T per il canale giallo utilizzando lo strumento Import (Importa). 16. La curva standard viene visualizzata nella finestra Standard Curve (Curva standard) per il canale verde. Visualizzare la linea di regressione calcolata, la pendenza (M), l intercetta y (B) e i valori R Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

33 Curva standard. 17. Visualizzare la concentrazione dei campioni sconosciuti. La finestra Quantitation Results Cycling A. Green (Risultati di quantificazione Ciclo A. Verde) visualizza i dati per i pozzetti selezionati e riassume la quantità di DNA presente nei campioni sconosciuti. L unità di misura è visualizzata in cima alla colonna. Finestra Quantitation Results Cycling A. Green (Risultati di quantificazione Ciclo A. Verde). La finestra Quantitation Results Cycling A. Yellow (Risultati di quantificazione Ciclo A. Giallo) visualizza i dati per i pozzetti selezionati e riassume i valori C T per il controllo interno. Manuale Investigator Quantiplex 10/

34 Finestra Quantitation Results Cycling A. Yellow (Risultati di quantificazione Ciclo A. Giallo). 18. Per esportare i risultati in Excel, cliccare con il tasto destro e selezionare Export to Excel (Esporta in Excel). I risultati vengono salvati in formato *.csv. Per esportare un report completo, cliccare su File, quindi su Reports e poi su Quantitation (Quantificazione). 19. Per interpretare i risultati, vedere Interpretazione dei risultati, pag Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

35 Protocollo: Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Questo protocollo è ottimizzato per l uso del kit Investigator Quantiplex sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, che utilizza il software SDS versione 1.4. Per le istruzioni generali sulla configurazione dello strumento e su altre versioni del software, consultare il manuale utente del sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Punti importanti prima di iniziare Preparare tutte le miscele di reazione in un area separata da quella utilizzata per l isolamento del DNA e per l analisi dei prodotti PCR (post- PCR). Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per ridurre al minimo una possibile cross-contaminazione. Nuovi coloranti non richiedono una calibrazione se si utilizza il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Utilizzare sempre le condizioni del ciclo specificate nel protocollo. Il ciclo è ottimizzato per questo test. Utilizzare sempre il volume di stampo specificato nel protocollo. La reazione è ottimizzata per l uso con 2 µl di DNA stampo. Non utilizzare una quantità superiore o inferiore a 2 µl per una reazione da 25 µl. Le diluizioni degli standard di quantificazione del DNA nel QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) possono essere conservate a 4 C per almeno 1 settimana. Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Procedura 1. Scongelare il DNA di controllo Z1 e il QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect). Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare il DNA di controllo Z1 a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). 2. Preparare diluizioni seriali fresche del DNA di controllo Z1 come da Tabella 7. Agitare su vortex per almeno 5 s e centrifugare Manuale Investigator Quantiplex 10/

36 brevemente ogni soluzione prima di rimuovere un aliquota per la diluizione successiva. Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni diluizione. Fare attenzione ad evitare casi di cross-contaminazione. Tabella 7. Diluizioni seriali del DNA di controllo Z1 Diluizione seriale del DNA di controllo Z1 DNA di controllo Z1 QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) 20 ng/µl DNA non diluito 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) e gli acidi nucleici stampo. Miscelare la provetta capovolgendola diverse volte. Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) e la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). 4. Preparare una miscela master come da Tabella 8. La miscela master contiene tutti i componenti necessari per la PCR, ad eccezione del DNA stampo (campione) e dell acqua priva di nucleasi. Preparare un volume di miscela master superiore del 10% a quello necessario per il numero complessivo di test PCR da eseguire. La miscela deve includere reazioni di controllo positive e negative. La reazione può essere di norma preparata a temperatura ambiente (15 25 C). Tuttavia, si consiglia di conservare i reagenti, i campioni e i controlli su ghiaccio oppure in un dispositivo refrigerante. 36 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

37 Tabella 8. Miscela master per la quantificazione del DNA Componente Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), 2,18x Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ), 2,18x Volume totale della miscela master Volume per reazione da 25 µl Concentrazione finale 11,5 µl 1x 11,5 µl 1x 23 µl 5. Miscelare accuratamente la miscela master e dispensarne 23 µl nelle provette per PCR o nei pozzetti di una piastra per PCR. 6. Aggiungere 2 µl di QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) alle provette o ai pozzetti NTC. Accertarsi che le provette NTC non vengano a contatto con il DNA umano. 7. Aggiungere 2 µl di diluizioni del DNA di controllo o 2 µl di DNA di campioni sconosciuti alle singole provette per PCR e miscelare accuratamente. Chiudere le provette per PCR. È molto importante miscelare attentamente per evitare concentrazioni localizzate di sale e DNA. La Tabella 9 mostra una possibile configurazione delle piastre. Accertarsi che la miscela master e lo stampo vengano accuratamente miscelati. È necessario inserire in ogni test e in ogni piastra di reazione duplicati delle diluizioni del DNA di controllo. Manuale Investigator Quantiplex 10/

38 Tabella 9. Possibile configurazione delle piastre di reazione sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Contenuto dei pozzetti A ,25 1,25 0,3125 0,3125 0,0781 0,0781 0,0195 0,0195 B 0,0049 0,0049 NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Tutte le quantità sono indicate in ng/µl. UNK: campione sconosciuto. 38 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

39 8. Aprire il software di rilevamento delle sequenze e selezionare Create a New Document (Crea un nuovo documento). Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Se non si utilizza un file template estrapolato dalla pagina prodotti dell Investigator Quantiplex, selezionare quanto segue nella finestra New Document Wizard (Procedura guidata nuovo documento). Assay (Test): Standard Curve (Absolute Quantification) (Curva standard (Quantificazione assoluta)) Container (Contenitore): 96-Well Clear Plate (Piastra trasparente a 96 pozzetti) Template (Stampo): Blank Document (Documento bianco) Run Mode (Modalità di esecuzione): Standard 7500 Creazione di un nuovo documento. Se si sta utilizzando un file template, selezionare quanto segue e passare alla fase 12. Assay (Test): Standard Curve (Absolute Quantification) (Curva standard (Quantificazione assoluta)) Container (Contenitore): 96-Well Clear Plate (Piastra trasparente a 96 pozzetti) Template (Stampo): Investigator_Quantiplex_Template_SDS1.4.SDT Run Mode (Modalità di esecuzione): Standard 7500 Manuale Investigator Quantiplex 10/

40 9. Aggiungere i rilevatori FAM e VIC al documento. Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Selezione dei rilevatori. 10. Selezionare i pozzetti in uso e spuntare la casella di entrambi i rilevatori. IMPORTANTE: Non selezionare i pozzetti non in uso (ovvero quelli senza miscela di reazione). Includendo i pozzetti non utilizzati si influenza significativamente la scala degli assi X e Y quando si esaminano i dati. Inserire le concentrazioni della curva standard nei pozzetti contenenti le reazioni di controllo per il rilevatore FAM. 11. Cliccare su Unknown (Sconosciuto) nella colonna Task (Attività), quindi selezionare Standard utilizzando il menu a tendina. Selezionare Quantity (Quantità) per il corrispondente rilevatore e inserire la quantità di DNA nel pozzetto. IMPORTANTE: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity (Quantità), occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task (Attività) del rilevatore VIC per le reazioni standard impostata su Unknown (Sconosciuto). Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). 40 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

41 Configurazione della piastra dei campioni. 12. Cliccare su Finish (Fine). Per programmare il termociclatore come da Tabella 10, cliccare sul tab Instrument (Strumento). La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi. La PCR con ciclo a due fasi richiede 40 cicli. Ogni ciclo comprende 2 fasi: 5 s a 95 C (fase di denaturazione) e 32 s a 60 C (fase di annealing/estensione). Tabella 10. Condizioni del ciclo per il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Fase Fase di attivazione della PCR iniziale Temp. Tempo Numero di cicli Commenti aggiuntivi 95 C 1 min La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi Ciclo a due fasi: Denaturazione Annealing / estensione combinate 95 C 60 C 5 s 32 s 40 cicli Effettuare la raccolta dei dati di fluorescenza Manuale Investigator Quantiplex 10/

42 13. Nel profilo termico cancellare la prima fase premendo Shift e cliccando all interno della fase di mantenimento dello Stage 1 (Stadio 1) (50 C per 2 min). Dopo aver selezionato la fase di mantenimento, premere il tasto Delete (Cancella). Modificare i tempi di mantenimento secondo quelli riportati nella Tabella 10. Accertarsi di modificare il volume del campione in 25 µl e di selezionare la modalità di esecuzione Standard L acquisizione dei dati va effettuata durante la fase di annealing/estensione combinata. Se si utilizza la versione del software, accertarsi di aver tolto la spunta dalla casella 9600 Emulation. Adattamento del profilo termico (software SDS versione 1.4). 14. Prima di processare la piastra di reazione, salvare il documento della piastra come file SDS (*.sds). Cliccare su File, quindi su Save (Salva). Inserire un nome per il documento della piastra, poi cliccare di nuovo su Save (Salva). 15. Caricare la piastra nello strumento. Accertarsi che la posizione A1 sulla piastra si trovi sul lato superiore sinistro del vassoio. 16. Avviare la reazione cliccando su Start. 42 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

43 Analisi dei dati Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Procedura 1. Aprire il file di esecuzione utilizzando il software SDS. Cliccare su File, poi su Open (Apri) e dopo ancora su Browse (Cerca) per localizzare il file salvato. 2. Occorre innanzi tutto definire gli standard prima di poter creare una curva standard. Se gli standard sono stati definiti prima dell inizio del processo, passare alla fase Cliccare su View (Visualizza) e selezionare Well Inspector (Ispettore pozzetto) dal menu. Nella colonna Task (Attività) definire come Standard i pozzetti contenenti gli standard di DNA per il canale FAM. IMPORTANTE: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity (Quantità), occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task (Attività) del rilevatore VIC per le reazioni standard impostata su Unknown (Sconosciuto). I valori Quantity (Quantità) non sono necessari per il controllo interno. Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). Finestra Well inspector (Ispettore pozzetto). Manuale Investigator Quantiplex 10/

44 4. Nel tab Amplification Plot (Grafico di amplificazione) (che si trova nel tab Results (Risultati)), selezionare i campioni adeguati nella tabella sotto il grafico di amplificazione. Selezionare Auto Ct per entrambi i canali e premere Analyze (Analizza). L impostazione del valore soglia adeguato può richiedere un ulteriore convalida interna presso il laboratorio. Analisi dei campioni per i canali FAM e VIC. 44 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

45 5. Per visualizzare la curva standard, selezionare il tab Standard Curve (Curva standard) (che si trova nel tab Results (Risultati)). Visualizzare i valori C T per le reazioni standard di quantificazione e la linea di regressione calcolata, la pendenza, l intercetta y e i valori R 2. Curva standard. Manuale Investigator Quantiplex 10/

46 6. Visualizzare la concentrazione dei campioni sconosciuti. Il report visualizza i dati relativi ai pozzetti selezionati e riassume la quantità di DNA presente nei campioni sconosciuti. Il rilevatore FAM mostra la quantità di DNA presente nella stessa unità di misura utilizzata per gli standard. Ad esempio, se è stata utilizzata l unità di misura ng/µl per la definizione degli standard, le quantità relative ai campioni sconosciuti verranno riportate in ng/µl. Il rilevatore VIC mostra il valore C T per il controllo interno. Concentrazione dei campioni sconosciuti. 7. Per esportare e salvare il report dei risultati, cliccare su File, quindi su Export (Esporta) e poi su Results (Risultati). Solo dopo che le impostazioni di analisi sono state salvate è possibile salvare i risultati nel formato Results Export Files *.csv (File di esportazione risultati *.csv). 8. Per interpretare i risultati, vedere Interpretazione dei risultati, pag Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

47 Protocollo: Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification Questo protocollo è ottimizzato per l uso del kit Investigator Quantiplex sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification, che utilizza il software di analisi della PCR in tempo reale HID versione 1.1. Per le istruzioni generali sulla configurazione dello strumento e su altre versioni del software, consultare il manuale utente del sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification User Manual). Punti importanti prima di iniziare Preparare tutte le miscele di reazione in un area separata da quella utilizzata per l isolamento del DNA e per l analisi dei prodotti PCR (post- PCR). Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per ridurre al minimo una possibile cross-contaminazione. I coloranti non richiedono una calibrazione personalizzata se si utilizza il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Tuttavia, si raccomanda di fare attenzione che il sistema sia calibrato per i coloranti standard VIC e FAM prima di iniziare il test. Per la corretta configurazione, consultare il manuale utente in dotazione allo strumento. Utilizzare sempre le condizioni del ciclo specificate nel protocollo. Il ciclo è ottimizzato per questo test. Utilizzare sempre il volume di stampo specificato nel protocollo. La reazione è ottimizzata per l uso con 2 µl di DNA stampo. Non utilizzare una quantità superiore o inferiore a 2 µl per una reazione da 25 µl. Le diluizioni degli standard di quantificazione del DNA nel tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect possono essere conservate a 4 C per almeno 1 settimana. Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Manuale Investigator Quantiplex 10/

48 Procedura 1. Scongelare il tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect. Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. 2. Preparare diluizioni seriali fresche del DNA di controllo Z1 come da Tabella 11. Agitare su vortex per almeno 5 s e centrifugare brevemente ogni soluzione prima di rimuovere un aliquota per la diluizione successiva. Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni diluizione. Fare attenzione ad evitare casi di cross-contaminazione. Tabella 11. Diluizioni seriali del DNA di controllo Z1 Diluizione seriale del DNA di controllo Z1 DNA di controllo Z1 Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect 20 ng/µl DNA non diluito 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Scongelare gli acidi nucleici stampo. Miscelare la miscela di reazione FQ e la miscela di primer IC FQ, capovolgendo la provetta diverse volte. Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. 48 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

49 4. Preparare una miscela master come indicato nella Tabella 12. La miscela master contiene tutti i componenti necessari per la PCR, ad eccezione del DNA stampo (campione) e dell acqua nuclease-free. Preparare un volume di miscela master superiore del 10% a quello necessario per il numero complessivo di test PCR da eseguire. La miscela deve includere reazioni di controllo positive e negative. La reazione può essere di norma preparata a temperatura ambiente (15-25 C). Tuttavia, si consiglia di conservare i reagenti, i campioni e i controlli su ghiaccio oppure in un dispositivo refrigerante. Tabella 12. Miscela master per la quantificazione del DNA Componente Volume per reazione da 25 µl Concentrazione finale Miscela di reazione FQ 11,5 µl 1x Miscela di primer IC FQ 11,5 µl 1x Volume totale della miscela master 23 µl 5. Miscelare accuratamente la miscela master e dispensarne 23 µl nei pozzetti di una piastra per PCR. 6. Aggiungere 2 µl di tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect ai pozzetti NTC. Accertarsi che i pozzetti NTC non vengano a contatto con DNA umano. 7. Aggiungere 2 µl di diluizioni del DNA di controllo o 2 µl di DNA di campioni sconosciuti ai singoli pozzetti e miscelare accuratamente. Chiudere la piastra. Miscelare attentamente per evitare concentrazioni localizzate di sale. La Table 13 mostra una possibile configurazione delle piastre. Accertarsi che la miscela master e lo stampo vengano accuratamente miscelati. È necessario inserire in ogni test e in ogni piastra di reazione duplicati delle diluizioni del DNA di controllo. Manuale Investigator Quantiplex 10/

50 Tabella 13. Possibile configurazione delle piastre di reazione sul sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR for Human Identification Contenuto dei pozzetti A B NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Tutte le quantità sono indicate in ng/µl. UNK: campione sconosciuto. 8. Aprire il software di analisi della PCR in tempo reale HID versione 1.1 nella modalità Custom Assays (test personalizzati). 9. Se si sta utilizzando un file template, selezionare New Experiment From Template (nuovo esperimento da template) e passare al punto 13 per assegnare i bersagli alla configurazione della piastra. Poi passare al punto 17 per salvare e avviare il processo. Il file template carica tutte le impostazioni necessarie per avviare un processo con Investigator Quantiplex, tra cui le impostazioni della curva standard, il profilo del ciclo e i bersagli necessari per l acquisizione della fluorescenza. 50 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

51 Avvio di un nuovo esperimento da un template. 10. Se non si utilizzano file template, selezionare Advanced Setup (impostazione avanzata) cliccando su Design Wizard (procedura guidata design). Avvio di un nuovo esperimento. Manuale Investigator Quantiplex 10/

52 Avvio di un nuovo esperimento utilizzando la configurazione avanzata. 11. Quando si apre la nuova finestra, inserire un nuovo "Experiment Name" (nome esperimento) nel campo appropriato. Selezionare le seguenti impostazioni: Strumento: 7500 (96 Wells) (7500 (96 pozzetti)) Tipo di esperimento: Quantitation Standard curve (quantificazione - curva standard) Reagenti: Other (altro) Velocità rampa: Standard Deselezionare l opzione Include Melt Curve (includi curva di fusione). 52 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

53 Specifiche degli strumenti 12. Cliccare su Plate Setup (configurazione piastra) e definire tre Targets (bersagli) cliccando due volte su Add New Target (aggiungi nuovo bersaglio). Selezionare le seguenti impostazioni: Human Target (bersaglio umano): Reporter FAM, Quencher: None (nessuno) IC: Reporter VIC, Quencher: None Manuale Investigator Quantiplex 10/

54 Definizione dei Targets. 13. Definire i nomi dei campioni utilizzando lo strumento Define Samples (definisci campioni) sul riquadro a destra. 14. Passare al tab Assign Targets and Samples (assegna bersagli e campioni). Nell opzione Plate Layout (layout piastre), selezionare i pozzetti in uso e assegnare tutti i tre Targets cliccando sulle caselle. Importante: Non selezionare i pozzetti non in uso (ovvero quelli senza miscela di reazione). Includendo i pozzetti non utilizzati si influenza significativamente la scala degli assi X e Y quando si esaminano i dati. 54 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

55 Assegnazione dei Targets. 15. Selezionare i pozzetti per i controlli no template e marcarli come Negative Control (controllo negativo) con il pulsante rosso N. Nota: Lasciare la funzione Task (attività) di IC (VIC) per le reazioni NTC impostata su Unknown (sconosciuto). Inserire il nome del campione. 16. Selezionare i pozzetti per la curva standard e marcarli come Standard con il pulsante rosso S. Selezionare Quantity (quantità) per il corrispondente rilevatore e inserire la quantità di DNA nel pozzetto come indicato nella Tabella 1. Importante: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity, occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task di IC (VIC) per le reazioni standard impostata su Unknown. Inserire il nome del campione. Manuale Investigator Quantiplex 10/

56 Impostazione della curva standard e assegnazione dei campioni alla configurazione delle piastre. 17. Assegnare i campioni alla configurazione delle piastre cliccando sui pozzetti e spuntando la casella corrispondente nel riquadro a sinistra. 18. Cliccare su Run Method (metodo di esecuzione). Programmare il termociclatore come indicato nella Table 14. La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi. La PCR con ciclo a due fasi richiede 40 cicli. Ogni ciclo comprende 2 fasi: 5 s a 95 C (fase di denaturazione) e 32 s a 60 C (fase di annealing/estensione). Tabella 14. Cycling conditions for the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Fase Fase di attivazione della PCR iniziale Temp. Durata Numero di cicli 95 C 1 minuto Commenti aggiuntivi La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per attivare la DNA polimerasi Ciclo a due fasi: Denaturazione 95 C 5 s Annealing / estensione combinate 40 cicli 60 C 32 s Effettuare la raccolta dei dati di fluorescenza 56 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

57 19. Nel profilo termico modificare i tempi di mantenimento secondo quelli indicati nella Tabella 12. Modificare il volume del campione portandolo a 25 µl. L acquisizione dei dati va effettuata durante la fase di annealing/estensione combinata. Adattamento del profilo termico (software di analisi della PCR in tempo reale HID versione 1.1). 20. rima di processare la piastra di reazione, salvare il documento della piastra come file EDS (*.eds). Cliccare su File, quindi su Save (salva). Inserire un nome per il documento della piastra, poi cliccare di nuovo su Save. 21. Caricare la piastra nello strumento. Accertarsi che la posizione A1 sulla piastra si trovi sul lato superiore sinistro del vassoio. 22. Avviare la reazione cliccando su Start (avvio). Manuale Investigator Quantiplex 10/

58 Analisi dei dati Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Procedura 1. Aprire il file di processo utilizzando il software di analisi della PCR in tempo reale HID versione 1.1. Il software deve essere già aperto nella modalità Custom Assays. Poi cliccare su Open (apri) e quindi su Browse (sfoglia) per localizzare il file salvato. 2. Occorre innanzi tutto definire gli standard prima di poter creare una curva standard. Se gli standard sono stati definiti prima dell inizio del processo, passare al punto Cliccare su Setup (configurazione) e selezionare Plate Setup. Definire i pozzetti che contengono gli standard di DNA come illustrato al punto 14. Importante: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity, occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task di IC (VIC) per le reazioni standard impostata su Unknown. Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). 4. Nel tab Amplification Plot (grafico di amplificazione) (che si trova nel tab Analysis (analisi)), selezionare i campioni adeguati nella tabella sotto il grafico di amplificazione. Selezionare Auto Ct per entrambi i canali e cliccare su Analyze (analizza). L impostazione del valore soglia adeguato può richiedere un ulteriore convalida interna presso il laboratorio. 58 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

59 Analisi dei campioni per i canali FAM e VIC. 5. Per visualizzare la curva standard, selezionare il tab Standard Curve (curva standard) (che si trova nel tab Results (risultati)). Visualizzare i valori C T per le reazioni standard di quantificazione e la linea di regressione calcolata, la pendenza, l intercetta y e i valori R 2. Curva standard. Manuale Investigator Quantiplex 10/

60 6. Visualizzare la concentrazione dei campioni sconosciuti. La Well Table (tabella pozzetti) visualizza i dati relativi ai pozzetti selezionati e riassume la quantità di DNA presente nei campioni sconosciuti. Human Target mostra la quantità di DNA presente nella stessa unità di misura utilizzata per gli standard (in altre parole: se è stata utilizzata l unità di misura ng/µl per la definizione degli standard, le quantità relative ai campioni sconosciuti verranno riportate in ng/µl). Il bersaglio IC mostra il valore C T per il controllo interno. Concentrazione dei campioni sconosciuti. 7. Per esportare e salvare il report dei risultati, cliccare su File, quindi su Export (esporta) e poi su Results. Solo dopo che le impostazioni di analisi sono state salvate è possibile salvare i risultati nel formato Results Export Files *.csv (file di esportazione risultati *.csv). 8. Per interpretare i risultati, vedere Interpretazione dei risultati, pag Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

61 Protocollo: Quantificazione del DNA utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Questo protocollo è ottimizzato per l uso del kit Investigator Quantiplex sul sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR, che utilizza il software SDS versione 1.4. Per le istruzioni generali sulla configurazione dello strumento e su altre versioni del software, consultare il manuale utente del sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR. Punti importanti prima di iniziare Preparare tutte le miscele di reazione in un area separata da quella utilizzata per l isolamento del DNA e per l analisi dei prodotti PCR (post- PCR). Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per ridurre al minimo una possibile cross-contaminazione. Nuovi coloranti non richiedono una calibrazione se si utilizza il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Utilizzare sempre le condizioni del ciclo specificate nel protocollo. Il ciclo è ottimizzato per questo test. Utilizzare sempre il volume di stampo specificato nel protocollo. La reazione è ottimizzata per l uso con 2 µl di DNA stampo. Non utilizzare una quantità superiore o inferiore a 2 µl per una reazione da 25 µl. Le diluizioni degli standard di quantificazione del DNA nel QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) possono essere conservate a 4 C per almeno 1 settimana. Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Manuale Investigator Quantiplex 10/

62 Procedura 1. Scongelare il DNA di controllo Z1 e il QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect). Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare il DNA di controllo Z1 a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). 2. Preparare diluizioni seriali fresche del DNA di controllo Z1 come da Tabella 15. Agitare su vortex per almeno 5 s e centrifugare brevemente ogni soluzione prima di rimuovere un aliquota per la diluizione successiva. Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni diluizione. Fare attenzione ad evitare casi di cross-contaminazione. Tabella 15. Diluizioni seriali del DNA di controllo Z1 Diluizione seriale del DNA di controllo Z1 DNA di controllo Z1 Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect 20 ng/µl DNA non diluito 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) e gli acidi nucleici stampo. Miscelare la provetta capovolgendola diverse volte. Miscelare accuratamente tutte le soluzioni prima dell uso per evitare concentrazioni localizzate di sale. Non scongelare la Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ) e la Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ) a temperature superiori a quella ambiente (15 25 C). 62 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

63 4. Preparare una miscela master come da Tabella 16. La miscela master contiene tutti i componenti necessari per la PCR, ad eccezione del DNA stampo (campione) e dell acqua priva di nucleasi. Preparare un volume di miscela master superiore del 10% a quello necessario per il numero complessivo di test PCR da eseguire. La miscela deve includere reazioni di controllo positive e negative. La reazione può essere di norma preparata a temperatura ambiente (15 25 C). Tuttavia, si consiglia di conservare i reagenti, i campioni e i controlli su ghiaccio oppure in un dispositivo refrigerante. Tabella 16. Miscela master per la quantificazione del DNA Componente Reaction Mix FQ (Miscela di reazione FQ), 2,18x Primer Mix IC FQ (Miscela di primer IC FQ), 2,18x Volume totale della miscela master Volume per reazione da 25 µl Concentrazione finale 11,5 µl 1x 11,5 µl 1x 23 µl 5. Miscelare accuratamente la miscela master e dispensarne 23 µl nelle provette per PCR o nei pozzetti di una piastra per PCR. 6. Aggiungere 2 µl di QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTect) alle provette o ai pozzetti NTC. Accertarsi che le provette NTC non vengano a contatto con il DNA umano. Manuale Investigator Quantiplex 10/

64 7. Aggiungere 2 µl di diluizioni del DNA di controllo o 2 µl di DNA di campioni sconosciuti alle singole provette per PCR e miscelare accuratamente. Chiudere le provette per PCR. È molto importante miscelare attentamente per evitare concentrazioni localizzate di sale. La Tabella 17 mostra una possibile configurazione delle piastre. Accertarsi che la miscela master e lo stampo vengano accuratamente miscelati. È necessario inserire in ogni test e in ogni piastra di reazione duplicati delle diluizioni del DNA di controllo. Tabella 17. Possibile configurazione delle piastre di reazione sul sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Contenuto dei pozzetti A ,25 1,25 0,3125 0,3125 0,0781 0,0781 0,0195 0,0195 B 0,0049 0,0049 NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Tutte le quantità sono indicate in ng/µl. UNK: campione sconosciuto. 8. Aprire il software di rilevamento delle sequenze e selezionare Create a New Document (Crea un nuovo documento). Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Se non si utilizza un file template estrapolato dalla pagina prodotti dell Investigator Quantiplex, selezionare quanto segue nella finestra New Document Wizard (Procedura guidata nuovo documento) che si è aperta. Assay (Test): Standard Curve (Absolute Quantification) (Curva standard (Quantificazione assoluta)) Container (Contenitore): 96-Well Clear Plate (Piastra trasparente a 96 pozzetti) Template (Stampo): Blank Document (Documento bianco) Run Mode (Modalità di esecuzione): Fast Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

65 Creazione di un nuovo documento. Se si sta utilizzando un file template, selezionare quanto segue e passare alla fase 12. Assay (Test): Standard Curve (Absolute Quantification) (Curva standard (Quantificazione assoluta)) Container (Contenitore): 96-Well Clear Plate (Piastra trasparente a 96 pozzetti) Template (Stampo): Investigator_Quantiplex_Template_SDS1.4_Fast.SDT Run Mode (Modalità di esecuzione): Fast Aggiungere i rilevatori FAM e VIC al documento. Cliccare su Next (Avanti) per continuare. Manuale Investigator Quantiplex 10/

66 Selezione dei rilevatori. 10. Selezionare i pozzetti in uso e spuntare la casella di entrambi i rilevatori. IMPORTANTE: Non selezionare i pozzetti non in uso (ovvero quelli senza miscela di reazione). Includendo i pozzetti non utilizzati si influenza significativamente la scala degli assi X e Y quando si esaminano i dati. Inserire le concentrazioni della curva standard nei pozzetti contenenti le reazioni di controllo per il rilevatore FAM. 11. Cliccare su Unknown (Sconosciuto) nella colonna Task (Attività), quindi selezionare Standard utilizzando il menu a tendina. Selezionare Quantity (Quantità) per il corrispondente rilevatore e inserire la quantità di DNA nel pozzetto. IMPORTANTE: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity (Quantità), occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task (Attività) del rilevatore VIC per le reazioni standard impostata su Unknown (Sconosciuto). Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). 66 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

67 Configurazione della piastra dei campioni. 12. Cliccare su Finish (Fine). Per programmare il termociclatore come da Tabella 18, cliccare sul tab Instrument (Strumento). La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi. La PCR con ciclo a due fasi richiede 40 cicli. Ogni ciclo comprende 2 fasi: 5 s a 95 C (fase di denaturazione) e 25 s a 60 C (fase di annealing/estensione). Tabella 18. Condizioni del ciclo per il sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Fase Fase di attivazione della PCR iniziale Temp. Tempo Numero di cicli Commenti aggiuntivi 95 C 1 min La PCR richiede un incubazione iniziale a 95 C per 1 min per attivare la DNA polimerasi Ciclo a due fasi: Denaturazione Annealing / estensione combinate 95 C 60 C 5 s 25 s 40 cicli Effettuare la raccolta dei dati di fluorescenza Manuale Investigator Quantiplex 10/

68 13. Nel profilo termico modificare i tempi di mantenimento secondo quelli indicati nella Tabella 18. Accertarsi di modificare il volume del campione in 25 µl e di selezionare la modalità di esecuzione Fast L acquisizione dei dati va effettuata durante la fase di annealing/estensione combinata. Adattamento del profilo termico (software SDS versione 1.4). 14. Prima di processare la piastra di reazione, salvare il documento della piastra come file SDS (*.sds). Cliccare su File, quindi su Save (Salva). Inserire un nome per il documento della piastra, poi cliccare di nuovo su Save (Salva). 15. Caricare la piastra nello strumento. Accertarsi che la posizione A1 sulla piastra si trovi sul lato superiore sinistro del vassoio. 16. Avviare la reazione cliccando su Start. 68 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

69 Analisi dei dati Definire impostazioni di analisi ottimali rappresenta un prerequisito per ottenere dati di quantificazione precisi. Regolare continuamente le impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e valori soglia) per l analisi di ogni canale del colorante reporter in ciascun processo. Procedura 1. Aprire il file di esecuzione utilizzando il software SDS. Cliccare su File, poi su Open (Apri) e dopo ancora su Browse (Cerca) per localizzare il file salvato. 2. Occorre innanzi tutto definire gli standard prima di poter creare una curva standard. Se gli standard sono stati definiti prima dell inizio del processo, passare alla fase Cliccare su View (Visualizza) e selezionare Well Inspector (Ispettore pozzetto) dal menu. Nella colonna Task (Attività) definire come Standard i pozzetti contenenti gli standard di DNA per il canale FAM. IMPORTANTE: Sebbene non vengano inserite le unità di misura per la voce Quantity (Quantità), occorre utilizzare un unità di misura comune per tutte le quantità standard (ad es. ng/µl). Le unità di misura utilizzate per le quantità standard definiscono le unità di misura di quantificazione per l analisi dei risultati. Nota: Lasciare la funzione Task (Attività) del rilevatore VIC per le reazioni standard impostata su Unknown (Sconosciuto). I valori Quantity (Quantità) non sono necessari per il controllo interno. Inserire il nome del campione (ad es. DNA di controllo Z1 20 ng/µl). Finestra Well inspector (Ispettore pozzetto). Manuale Investigator Quantiplex 10/

70 4. Nel tab Amplification Plot (Grafico di amplificazione) (che si trova nel tab Results (Risultati)), selezionare i campioni adeguati nella tabella sotto il grafico di amplificazione. Selezionare Auto Ct per entrambi i canali e cliccare su Analyze (Analizza). L impostazione del valore soglia adeguato può richiedere un ulteriore convalida interna presso il laboratorio. Analisi dei campioni per i canali FAM e VIC. 70 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

71 5. Per visualizzare la curva standard, selezionare il tab Standard Curve (Curva standard) (che si trova nel tab Results (Risultati)). Visualizzare i valori C T per le reazioni standard di quantificazione e la linea di regressione calcolata, la pendenza, l intercetta y e i valori R 2. Curva standard. Manuale Investigator Quantiplex 10/

72 6. Visualizzare la concentrazione dei campioni sconosciuti. Il report visualizza i dati relativi ai pozzetti selezionati e riassume la quantità di DNA presente nei campioni sconosciuti. Il rilevatore FAM mostra la quantità di DNA presente nella stessa unità di misura utilizzata per gli standard. Ad esempio, se è stata utilizzata l unità di misura ng/µl per la definizione degli standard, le quantità relative ai campioni sconosciuti verranno riportate in ng/µl. Il rilevatore VIC mostra il valore C T per il controllo interno. Concentrazione dei campioni sconosciuti. 7. Per esportare e salvare il report dei risultati, cliccare su File, quindi su Export (Esporta) e poi su Results (Risultati). Solo dopo che le impostazioni di analisi sono state salvate è possibile salvare i risultati nel formato Results Export Files *.csv (File di esportazione risultati *.csv). 8. Per interpretare i risultati, vedere Interpretazione dei risultati, pag Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

73 Interpretazione dei risultati Considerazioni generali per l analisi dei dati I dati PCR in tempo reale vengono visualizzati sotto forma di grafici di amplificazione sigmoidali (se si utilizza una scala lineare), in cui viene rappresentata la fluorescenza rispetto al numero di cicli. Il ciclo soglia (valore C T ) funge da strumento per il calcolo della quantità di stampo iniziale in ogni campione. Questo è il ciclo in cui avviene un primo significativo aumento rilevabile della fluorescenza. L impostazione ottimale di soglia dipende dalle chimiche di reazione utilizzate per la PCR. Ciò significa che un impostazione ottimale di soglia definita per un altro kit potrebbe non essere adatta per il kit Quantiplex Kit, e ciò potrebbe richiedere un adattamento dell impostazione. Per la quantificazione del DNA che utilizza il kit Investigator Quantiplex, le impostazioni di analisi devono essere adattate per entrambi i coloranti reporter. Curva standard La curva standard è la curva best fit per una regressione lineare secondo le serie di diluizioni standard. L equazione è come segue: y = mx + b dove x = concentrazione logaritmica e y = C T. Pendenza La pendenza (m) descrive l efficacia della PCR. Una pendenza di 3,3 indica una totale efficacia della PCR (ciò significa che il numero di copie del prodotto di amplificazione è raddoppiato in ogni ciclo). Di norma, la pendenza varia fra 3,0 e 3,6. Se i valori sono esterni a questo intervallo, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi, pag. 76, per maggiori informazioni. Intercetta y L intercetta y (b) indica il valore C T previsto per un campione con Qty (quantità) = 1 (ad esempio 1 ng/µl). Manuale Investigator Quantiplex 10/

74 Valore R 2 Il valore R 2 è una misura del fit dei punti dati secondo la linea di regressione. In linea generale, la curva standard presenta un valore R 2 0,990. Possono verificarsi bassi valori R 2 (R 2 0,98) per diversi motivi. In caso di bassi valori R 2, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi, pag. 76, per maggiori informazioni. Controllo interno Il controllo interno consente di individuare eventuali anomalie nella chimica e nello strumento, errori nel setup del test e la presenza di inibitori nel campione. Il sistema è studiato per essere più sensibile verso eventuali inibitori rispetto al bersaglio specifico per il DNA umano. Pertanto, la quantificazione risulta valida anche se viene rilevata la presenza di qualche inibitore nel campione. In questo caso, l operatore ottiene le informazioni relative alla concentrazione del DNA nel campione e alla presenza di inibitori. Il confronto fra il valore C T del sistema IC per gli standard di DNA e il valore C T del sistema IC per campioni sconosciuti può fornire un indicazione di una potenziale inibizione. Ad elevate concentrazioni di inibitori, i dati di quantificazione possono essere influenzati, pertanto questo aspetto va considerato per le applicazioni a valle. Un amplificazione positivo del sistema IC genera un valore C T di circa 31. Il sistema del controllo interno è un sistema molto sensibile per l individuazione di inibitori; pertanto, è prevedibile una variazione di 1 2 C T fra i campioni della curva standard. L impiego di elevati livelli di DNA umano (>150 ng/reazione) può produrre un valore C T superiore per il sistema IC. Il risultato dell IC deve essere considerato nel contesto del risultato del bersaglio specifico per il DNA umano. Possono verificarsi le situazioni illustrate nella Tabella Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

75 Tabella 19. Potenziali risultati di amplificazione e relativa interpretazione Bersaglio umano specifico Controllo interno Interpretazione Nessuna amplificazione Amplificazione positiva Nessun DNA umano rilevato Nessuna amplificazione Nessuna amplificazione Risultato non valido Amplificazione positiva con basso valore C T ed elevato segnale di fluorescenza Amplificazione positiva con elevato valore C T e basso segnale di fluorescenza Nessuna amplificazione o C T superiore a 32 Nessuna amplificazione o C T superiore a 32 Risultato IC inconcludente Presenza di inibitori della PCR Si raccomanda di eseguire una convalida interna di laboratorio con importanti inibitori per stabilire i criteri di rilevamento dell inibizione. Quantificazione dei campioni sconosciuti Il kit Investigator Quantiplex può quantificare un ampia gamma di quantità di DNA in un campione da 75 ng/µl a circa 0,5 pg/µl con un intervallo altamente lineare fra 20 ng/µl e 4,9 pg/µl per il DNA genomico umano. Quando vengono caricati in una reazione 2 µl di un campione a concentrazioni molto basse, il pozzetto contiene circa 1 1,5 equivalenti di genoma umano diploide. Nell intervallo a basse concentrazioni di DNA, gli effetti statistici noti come variazioni stocastiche possono influenzare significativamente il risultato del test. Quando si utilizzano campioni contenenti basse concentrazioni di DNA, accertarsi che vengano inclusi quanti più replicati possibili per confermare il risultato. Manuale Investigator Quantiplex 10/

76 Guida alla risoluzione dei problemi Questa guida alla risoluzione dei problemi può essere utile per chiarire eventuali dubbi che possano presentarsi. Per maggiori informazioni, consultare anche la pagina relativa alle domande frequenti (FAQ) nel nostro servizio di assistenza tecnica: I ricercatori addetti ai servizi di assistenza tecnica della QIAGEN sono sempre lieti di rispondere a qualsiasi domanda riguardante le informazioni e i protocolli presenti in questo manuale, o le tecnologie per campioni e analisi (per le informazioni sui contatti, vedere il retro della copertina oppure visitare il sito Commenti e suggerimenti Nessun segnale oppure uno o più segnali rilevati in ritardo nella reazione PCR a) Condizioni del ciclo errate Utilizzare sempre le condizioni del ciclo ottimizzate, specificate nei protocolli. Accertarsi di selezionare ROX come colorante passivo nei sistemi Applied Biosystems. b) Errore di pipettaggio, reagente mancante o degradato c) Fase di rilevamento errata o mancante d) Quantità insufficiente di stampo iniziale e) Problemi con il DNA stampo iniziale Controllare le condizioni di conservazione dei reagenti. Ripetere il test. Accertarsi che durante la fase di annealing/estensione combinata avvenga il rilevamento della fluorescenza. Aumentare la quantità di stampo, se possibile. Accertarsi che siano presenti sufficienti copie del DNA stampo nel campione. Controllare le condizioni di conservazione del DNA stampo iniziale. Un efficace eliminazione degli inibitori della PCR è fondamentale per ottenere risultati ottimali. Purificare gli acidi nucleici dal campione utilizzando un metodo di purificazione adeguato. Accertarsi che tutti i reagenti, i tamponi e le soluzioni utilizzati per l isolamento e la diluizione degli acidi nucleici stampo siano privi di nucleasi. 76 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

77 f) Scelta di un canale/filtro di rilevamento errato g) DNA di controllo degradato Commenti e suggerimenti Accertarsi che sia attivato il canale di rilevamento corretto oppure che sia selezionato il set di filtri corretto per ogni colorante reporter. Accertarsi che la combinazione selezionata di coloranti reporter sia compatibile con i canali di rilevamento selezionati o i set di filtri. Creare nuove diluizioni seriali del DNA di controllo dalla soluzione madre. Ripetere il test utilizzando le nuove diluizioni. Differenze nei valori C T o nell efficacia della PCR fra vari processi a) Condizioni del ciclo errate Avviare sempre il processo con le condizioni del ciclo ottimizzate, specificate nei protocolli. Accertarsi che le condizioni del ciclo includano la fase iniziale per l attivazione della DNA polimerasi (95 C per 1 min) e i tempi specificati per la fase di denaturazione e annealing/estensione. b) Impostazioni di analisi (ad es. impostazioni al basale e soglia) non ottimali Controllare le impostazioni di analisi (impostazioni al basale e soglia) per ogni colorante reporter. Ripetere l analisi utilizzando impostazioni ottimali per ogni colorante reporter. In alcuni casi, la variazione manuale della soglia consente di ottenere l efficienza ottimale della reazione e il valore R 2. Mancanza di linearità nel rapporto fra il valore C T /punto d incrocio e il logaritmo della quantità di stampo La quantità di stampo nei campioni sconosciuti è troppo elevata La linearità è garantita entro l intervallo della curva standard. Quando appaiono segnali in presenza di valori C T molto precoci, diluire il campione e ripetere la reazione. Aumento della fluorescenza o del valore C T per il controllo no template a) Contaminazione dei reagenti Gettare tutti i componenti del test (ad es. miscela master). Ripetere il test utilizzando nuovi componenti. Manuale Investigator Quantiplex 10/

78 b) Degradazione minima della sonda, con conseguente aumento variabile della fluorescenza Commenti e suggerimenti Controllare i grafici di amplificazione e adattare le impostazioni soglia. c) Problemi di diafonia In base al tipo di strumento, si utilizzano diverse tecniche per evitare la diafonia spettrale quando si impiegano più fluorocromi per test in multiplex. Tuttavia, è possibile osservare una diafonia minima come conseguenza della sovrapposizione spettrale residua nei pozzetti NTC, in particolare se lo strumento necessita di calibrazione. Intensità di fluorescenza variabile a) Contaminazione del termociclatore in tempo reale Le reazioni sono state contaminate con il DNA bersaglio. Decontaminare le stazioni di lavoro in tempo reale e il termociclatore secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare nuovi reagenti e soluzioni. b) Termociclatore in tempo reale non più calibrato c) Curva fluttuante ad elevate quantità di stampo per bersagli altamente concentrati Ricalibrare il termociclatore in tempo reale secondo le istruzioni del produttore. Nelle impostazioni di analisi, ridurre il numero di cicli utilizzati per il calcolo di base (se il termociclatore lo consente) o ridurre la quantità di stampo. La pendenza della curva standard differisce significativamente da 3,33 oppure il valore R 2 è significativamente inferiore a 0,98 0,99 a) Contaminazione del termociclatore in tempo reale Decontaminare il termociclatore in tempo reale secondo le istruzioni del produttore. b) Termociclatore in tempo reale e/o pipette non più calibrati Ricalibrare il termociclatore in tempo reale secondo le istruzioni del produttore. Calibrare le pipette per ridurre al minimo la variabilità di pipettaggio. 78 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

79 c) Curva fluttuante ad elevate quantità di stampo per bersagli altamente concentrati d) Problema con la diluizione degli standard e) La piastra non era sigillata f) È stato commesso un errore durante la diluizione dello standard di DNA g) Sono stati inseriti valori di concentrazione errati nel software Commenti e suggerimenti Nelle impostazioni di analisi, ridurre il numero di cicli utilizzati per il calcolo di base o ridurre la quantità di stampo. Accertarsi che lo standard di DNA sia completamente scongelato e accuratamente miscelato prima dell uso. Accertarsi che le diluizioni dello standard di DNA siano accuratamente miscelate prima di rimuovere ogni aliquota per la diluizione seriale. Non utilizzare un volume di campione diverso da 2 µl. Modificare i puntali per pipetta fra ogni fase di diluizione. Sigillare accuratamente le piastre per evitare l evaporazione. Verificare tutti i calcoli e ripetere la diluizione dello standard di DNA. Verificare le concentrazioni per tutti i campioni utilizzati per generare la curva standard. h) Fluorescenza anomala Non scrivere sulla piastra. Osservare cautela durante la manipolazione delle piastre. Indossare guanti. i) Variazione statistica È normale una qualche variazione nella reazione, in particolare se il DNA bersaglio è presente in un ridotto numero di copie. Eseguire la curva standard almeno in duplicato per ridurre al minimo l effetto di tale variazione. Rimuovere la diluizione da 0, ng/µl dello standard di DNA standard dalla curva standard modificando il tipo di campione in Unknown (Sconosciuto). Manuale Investigator Quantiplex 10/

80 Riferimenti bibliografici QIAGEN possiede un ampia banca dati online continuamente aggiornata con le pubblicazioni scientifiche riguardanti i prodotti QIAGEN. Opzioni di ricerca specifiche consentono di trovare gli articoli necessari sia per parole chiave sia specificando l applicazione, l area di ricerca, il titolo, ecc. Per un elenco bibliografico completo, visitare il QIAGEN Reference Database online nel sito oppure contattare il centro di assistenza tecnica QIAGEN o il distributore locale. Riferimento citato Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S.P., Brown, T. and Little, S. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat. Biotechnol. 17, Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

81 Informazioni per gli ordini Prodotto Contenuto Cat. n Investigator Quantiplex Kit (200) Prodotti correlate Miscela di reazione FQ, miscela di primer IC FQ, DNA di controllo Z1, tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTec Investigator Quantiplex HYres Kit (200) Miscela di reazione FQ, miscela di primer IC YQ, DNA di controllo Z1, tampone di diluizione dell acido nucleico QuantiTec Kit Investigator Human Identification PCR Investigator ESSplex Plus Kit * Investigator ESSplex SE Plus Kit* Investigator IDplex Plus Kit* Investigator Nonaplex ESS Kit (100)* Investigator HDplex Kit (25)* Investigator Triplex AFS QS Kit (100)* Investigator Triplex DSF Kit (100)* Miscela primer, miscela di reazione rapida con HotStarTaq Plus Polimerasi DNA, DNA di controllo, ladder allelico ESSplex Plus, DNA size standard 550 (BTO) e acqua nuclease-free Miscela primer, miscela di reazione rapida con HotStarTaq Plus Polimerasi DNA, DNA di controllo, ladder allelico ESSplex SE Plus, DNA size standard 550 (BTO) e acqua nuclease-free Miscela primer, miscela di reazione rapida con HotStarTaq Plus Polimerasi DNA, DNA di controllo, ladder allelico IDplex Plus, DNA size standard 550 (BTO) e acqua nucleasefree Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Manuale Investigator Quantiplex 10/

82 Prodotto Contenuto Cat. n Investigator Argus X-12 Kit (25)* Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Investigator Argus Y-12 QS Kit (100)* Investigator DIPplex Kit (25)* Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Miscela di primer, miscela di reazione, DNA polimerasi, DNA di controllo, ladder allelico, DNA size standard e acqua priva di nucleasi Software Investigator IDproof Software Investigator IDproof Versione completa Investigator IDproof Demo Key Investigator IDproof Single Key Investigator IDproof Server Key Investigator IDproof Mixture Client Key Licenza per la versione dimostrativa del software; valida per 30 giorni Licenza per la versione desktop del software da installare su una singola stazione di lavoro con database locale Licenza per consentire la configurazione di un server che gestisce il database e varie stazioni di lavoro per accedere in detto database. Deve essere acquistato assieme al Client Key La licenza deve essere acquistata assieme al Server Key Software di miscelazione Investigator IDproof Software di miscelazione Investigator IDproof Versione completa Investigator IDproof Mixture Demo Key Licenza per la versione dimostrativa del software; valida per 30 giorni * Sono disponibili dimensioni del kit più grandi; si prega di chiedere informazioni. 82 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

83 Prodotto Contenuto Cat. n Investigator IDproof Mixture Single Key Licenza per la versione desktop del software da installare su una singola stazione di lavoro con database locale Investigator IDproof Mixture Server Key Investigator IDproof Mixture Client Key Licenza per consentire la configurazione di un server che gestisce il database e varie stazioni di lavoro per accedere in detto database. Deve essere acquistato assieme al Client Key La licenza deve essere acquistata assieme al Server Key Estrazione e purificazione del DNA QIAamp DNA Investigator Kit (50) 50 colonne QIAamp MinElute, proteinasi K, carrier RNA, tamponi, provette di raccolta (2 ml) MinElute Reaction Cleanup Kit (50)* Rotor-Gene Q 50 colonne Spin MinElute, tamponi, provette di raccolta (2 ml) Rotor-Gene Q 2plex Termociclatore per PCR in tempo reale a 2 canali, notebook, software, accessori, 1 anno di garanzia su parti e materiali Chiedere Rotor-Gene Q 2plex HRM Termociclatore per PCR in tempo reale e analizzatore ad alta risoluzione (High Resolution Melt analyzer) a 2 canali, più canale HRM, notebook, software, accessori, 1 anno di garanzia su parti e materiali Chiedere Rotor-Gene Q 5plex Termociclatore per PCR in tempo reale a 5 canali (verde, giallo, arancio, rosso, cremisi), notebook, software, accessori, 1 anno di garanzia su parti e materiali Chiedere Rotor-Gene Q 5plex HRM Termociclatore per PCR in tempo reale e analizzatore ad alta risoluzione (High Resolution Melt analyzer) a 5 canali, più canale HRM, notebook, software, accessori, 1 anno di garanzia su parti e materiali Chiedere * Sono disponibili dimensioni del kit più grandi; si prega di chiedere informazioni. Manuale Investigator Quantiplex 10/

84 Prodotto Contenuto Cat. n Rotor-Gene Q 6plex Termociclatore per PCR in tempo reale a 6 canali, incluso notebook, software, accessori, 1 anno di garanzia su parti e materiali Chiedere Per le informazioni di licenza aggiornate e i disclaimer specifici dei prodotti consultare il manuale specifico del kit QIAGEN. I manuali dei kit e i manuali utente QIAGEN sono disponibili nel sito oppure possono essere richiesti al servizio di assistenza tecnica QIAGEN o al proprio distributore locale. 84 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

85 Note Manuale Investigator Quantiplex 10/

86 Note 86 Manuale Investigator Quantiplex 10/2012

87 Marchi: QIAGEN, QIAamp, QIAgility, Investigator, MinElute, QuantiTect, Rotor-Gene, Scorpions (Gruppo QIAGEN); Applied Biosystems, FAM, VIC (Life Technologies Corporation). I marchi, nomi registrati ecc. utilizzati nel presente documento, anche se non contrassegnati specificamente come tali, vanno considerati protetti dalla legge. Contratto di Licenza per il kit Investigator Quantiplex L uso di questo prodotto implica l accettazione da parte dell acquirente o dell utente del prodotto dei seguenti termini: 1. Questo prodotto può essere utilizzato esclusivamente in conformità ai protocolli forniti insieme al prodotto e al presente manuale e soltanto con i componenti contenuti nel kit. QIAGEN non concede alcuna licenza, in relazione a qualunque proprietà intellettuale, per l uso o l aggiunta dei componenti del kit ad altri componenti non contenuti nel kit, ad eccezione di quanto descritto nei protocolli forniti col prodotto, il presente manuale e nei protocolli aggiuntivi disponibili sul sito Alcuni di questi protocolli aggiuntivi sono stati forniti da utenti QIAGEN per altri utenti QIAGEN. Tali protocolli non sono stati completamente testati od ottimizzati da QIAGEN. QIAGEN non garantisce in alcun modo che non violino i diritti di terze parti. 2. Se non espressamente dichiarato nelle licenze, QIAGEN non garantisce in alcun modo che questi kit e/o il relativo impiego non violino i diritti di terze parti. 3. Il presente kit ed i relativi componenti sono concessi in licenza per l impiego monouso e non possono essere riutilizzati, ripristinati o rivenduti. 4. QIAGEN esclude specificamente qualunque altra licenza, espressa o implicita, che non rientri tra quelle espressamente dichiarate. 5. L acquirente e l utente del kit concordano nel non consentire a nessuno di intervenire o consentire ad altri di realizzare o contribuire a realizzare azioni proibite. QIAGEN può imporre presso qualunque tribunale i divieti del presente Contratto di Licenza Limitato, e recupererà tutte le spese di indagine e spese legali, comprese le parcelle degli avvocati, in qualunque azione per imporre il presente Contratto di Licenza Limitato o qualsiasi diritto di proprietà intellettuale correlato al kit e/o ai suoi componenti. Per le condizioni di licenza aggiornate, consultare il sito QIAGEN, tutti i diritti riservati.

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