Lezione 2: Allineamento di sequenze. BLAST e CLUSTALW

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1 Lezione 2: Allineamento di sequenze BLAST e CLUSTALW

2 Allineamento di sequenze

3 Allineamenti L avvento della genomica moderna permette di analizzare le similitudini e le differenze tra organismi a livello del loro DNA e del loro corredo proteico completo ( informazioni evolutive, sequenze funzionali conservate, omologia tra geni ). Parallelamente, una attività comune in biologia è, data una sequenza di acidi nucleici o proteine di interesse sperimentale, di trovare sequenze simili all interno di gruppi di altre sequenze note. Molte di queste attività si possono ricondurre al problema di trovare o meno similarità tra sequenze di DNA o di amminoacidi. Ovvero, in generale, data una sequenza A (di DNA o amminoacidi) detta query e una sequenza B detta target, di allineare le due sequenze ovvero appaiare le loro singole componenti in modo da evidenziarne le zone somiglianti e quelle differenti.

4 Allineamenti Data una sequenza (DNA/proteina), ci sono oggetti simili in un certo database oppure ci sono somiglianze con altre sequenze che mi interessano? Ho trovato un nuovo gene o proteina? Un certo gene ha somiglianze con qualche altro gene nella stessa specie o in altre specie? Come posso trovare le regione di sovrapposizione tra sequenze? Come posso studiare l evoluzione di genomi di popolazioni o specie? Come posso trovare informazioni sul tipo di fold, sulla famiglia, sulla funzione di una certa proteina? allineamento di sequenze

5 Allineamenti Un tipico risultato di una procedura di allineamento è il seguente: Conservation in GABPA promoter region reveals functional Err-α motif. Asterisks denote conserved bases. The yellow box marks the experimentally validated Err- α binding site. Xie et al., Nature 2005

6 Allineamenti L operazione di allineamento però non è banale da realizzare. Allineare trovare le corrispondenze, posizione per posizione, tra due o più sequenze. A priori, ci sono molti modi di allineare due sequenze. Supponiamo di voler allineare le due sequenze di DNA ACGTCTAG ed ACTCTAG: DOMANDA: Quale è l allineamento (statisticamente) migliore?

7 Allineamenti Oppure supponiamo di voler allineare la sequenza TCTAG con una sequenza di DNA molto lunga: se partiamo da una sequenza abbastanza piccola e la vogliamo allineare con una sequenza abbastanza lunga, potremmo sempre ottenere un accordo perfetto tra elementi appaiati delle due stringhe se permettiamo un numero arbitrario di gaps. DOMANDA: Ma quale di questi allineamenti è quello (statisticamente) più significativo?

8 Allineamenti Concentrandosi all inizio sul problema di allineare coppie di sequenze, possiamo distinguere tra: - allineamento globale si cercano similarità sull intera - allineamento locale sequenza si cercano corte regioni ad alta similarità comprese dentro le sequenze di partenza Gli algoritmi e i metodi di allineamento sono simili, ma non uguali tra sequenze di DNA e proteine (escluse ulteriori considerazioni strutturali: cfr parte di proteomica del corso). Ad ogni procedura di allineamento corrisponde in generale un significato dal punto di vista evolutivo. Ad esempio, le inserzioni / delezioni / gaps degli esempi precedenti che significato biologico potrebbero avere?

9 Allineamenti Concentrandosi all inizio sul problema di allineare coppie di sequenze, possiamo distinguere tra: - allineamento globale si cercano similarità sull intera - allineamento locale sequenza si cercano corte regioni ad alta similarità comprese dentro le sequenze di partenza Gli algoritmi e i metodi di allineamento sono simili, ma non uguali tra sequenze di DNA e proteine (escluse ulteriori considerazioni strutturali: cfr parte di Zamma). Ad ogni procedura di allineamento corrisponde in generale un significato dal punto di vista evolutivo. Ad esempio, le inserzioni / delezioni / gaps degli esempi precedenti che significato biologico potrebbero avere?

10 Toy example Vogliamo allineare la sequenza WHAT con la sequenza WHY. Vogliamo in oltre determinare l allineamento più significativo. Per fare questo, costruiamo delle regole per costruire ogni possibile allineamento e per assegnare un punteggio (score) ad ognuno di essi. regola (algoritmo) per costruire tutti i possibili allineamenti regola (algoritmo) per assegnare uno score S ad ogni allineamento prendere l allineamento con score massimo Regole ad es: Allineamento ad es:

11 Toy example Più in generale: costruzione della matrice di allineamento della sequenza WHAT con la sequenza WHY: La matrice descrive tutti i possibili allineamenti della sequenza target con la sequenza query. Un particolare allineamento è un percorso nella matrice.

12 Toy example Ogni passo da un elemento della matrice ad una altro corrisponde ad uno spostamento su un nuovo elemento di una od entrambe le sequenze. Ad ogni passo, possiamo scrivere nell elemento di matrice lo score fino a quel punto. Il migliore allineamento è il percorso che genera lo score più alto, arrivando in basso a destra nella matrice, ovvero avendo usato tutte le lettere a disposizione di query e di target (allineamento globale).

13 Toy example 1) 2) Con queste regole la matrice di allineamento completa per il nostro esempio WHAT / WHY è:

14 Toy example 1) 2) Con queste regole la matrice di allineamento completa per il nostro esempio WHAT / WHY è:

15 Toy example 1) 2) Con queste regole la matrice di allineamento completa per il nostro esempio WHAT / WHY è:

16 Allineamento globale: formalismi In generale un allineamento globale si può scrivere come: - date due sequenze A e B di simboli, non necessariamente della stessa lunghezza ma scritte nello stesso alfabeto Scrivere una successione del tipo: le sequenze sono allineate secondo la loro lunghezza. Si inseriscono gaps se hanno lunghezze diverse. Needleman e Wunsch (1970)

17 Allineamento globale: formalismi In particolare: se le lettere ai e bj allineate sono uguale si ha una identity, altrimenti si ha un mismach. Se devo allungare l allineamento ho un indel. Lo score per aver allineato le prime i lettere di A con le prime j lettere di B è: Calcolato in maniera ricorsiva a partire da:

18 Allineamento locale Proteine con la stessa funzione possono presentare degli allineamenti di sequenza reciproci poco significativi, a causa di piccole zone di similarità racchiuse dentro zone di apparente forte diversità e/o lunghezze molto diverse. In questo casi è preferibile cercare degli allineamenti locali, cioe corti allineamenti contenuti all interno delle sequenze più lunghe (Smith e Waterman, 1981). La tecnica per calcolare allineamenti locali è sempre basata sulla costruzione di una matrice di allineamento, e cercando poi il percorso con lo score più alto. Solo che nel caso dell allineamento locale: il percorso migliore attraverserà solo parte della matrice non c è richiesta di allineare le stringhe agli estremi.

19 Allineamento locale: esempio Trovare il migliore allineamento locale e il massimo score di allineamento date le due sequenze A =ACCTAAGG e B = GGCTCAATCA.

20 Numero dei possibili allineamenti globali Date due sequenze di lunghezza m ed n per calcolarne il migliore allineamento globale, abbiamo calcolato 3 score per andare in (n-1)(m-1) celle e poi prenderne il massimo quindi circa 4mn operazioni un singolo allineamento globale è una operazione di classe O(mn). Ma quanti sono i possibili allineamenti globali? Se supponiamo per semplicità che m ~ n è possibile dimostrare che: Questo numero è gigantesco!!!!

21 Numero dei possibili allineamenti globali Supponiamo ad esempio di avere: Supponiamo ad esempio di avere: Il Sole pesa circa 1.99 x 1033 grammi. Ogni grammo contiene circa 12 x tra protoni, elettroni e neutroni, per cui il Sole contiene circa 24 x particelle elementari. ci vorrebbero 400 stelle come il Sole per contenere tante particelle elementari quanti sono gli allineamenti di due sequenze di 100 caratteri.

22 Regole di scoring (DNA) Lo scoring delle singole mosse in un allineamento deve essere fissato all inizio una volta per tutte in una scoring matrix una scelta precisa di un modello evolutivo per il nostro allineamento. Nei casi precedenti, le regole di scoring usate si possono riassumere in:

23 Regole di scoring (DNA) Sono però possibili scelte diverse. Studi di mutazioni su geni omologhi hanno indicato che le transizioni (A G, G A, C T, or T C) capitano in media con una frequenza doppia delle transversioni (A T, T A, A C, G T, etc). Quindi un modello di allineamento più sensato potrebbe utilizzare degli scores diversi per transizioni o per transversioni (e.s. sequenze simili hanno la tendenza ad avere transizioni, per cui il loro peso statistico dovrebbe essere inferiore). Una scoring matrix più realistica allora potrebbe essere:

24 Regole di scoring (DNA) Analogamente sorge il problema di come esattamente valutare lo scoring dei gaps (successioni di indels). Fino ad adesso abbiamo usato la regola semplice: come score per un gap di lunghezza k. Tuttavia è noto, per esempio che i gaps appaiono più facilmente in successione che isolati (cfr. biochimica). Inoltre, come altro esempio, delezioni di uno o due nucleotidi in regioni protein-coding in genere sono estremamente dannosi, mentre delezioni o inserzioni di gruppi di 3 nucleotidi lo sono di meno (frameshift). Un approccio potrebbe essere allora usare una regola del tipo: che ha l effetto di avere una alta penalità per aprire un primo gap α e una penalità inferiore per allargare un gap (-β per ogni base in più nel gap, con α < β).

25 Regole di scoring (proteine) Per gli amminoacidi le regole di accoppiamento sono più complesse: Nucleotidi: identità AGGCTGACCTGGGAAGGGAAACTCTCAAAACCAT AGGATGAGCT-GGAAGGATA-CTCTCAAAAACAT *** *** ** ******* ** ******** *** Amminoacidi: identità + somiglianza VLSSADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFL VLSAADKANIKAAW-KVGGQAGDHGAEALERMPL ***:*** *:**** ***: **: ******** *

26 Regole di scoring (proteine) Per gli amminoacidi le regole di accoppiamento sono più complesse: Nucleotidi: identità AGGCTGACCTGGGAAGGGAAACTCTCAAAACCAT AGGATGAGCT-GGAAGGATA-CTCTCAAAAACAT *** *** ** ******* ** ******** *** Amminoacidi: identità + somiglianza VLSSADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFL VLSAADKANIKAAW-KVGGQAGDHGAEALERMPL ***:*** *:**** ***: **: ******** *

27 Regole di scoring (proteine) Le scoring matrix degli amminoacidi sono più complesse di quelle per i nucleotidi. Sono delle tabelle che danno per ciascuna coppia di aa, un valore che indica il loro grado di similarità (informazione sulla probabilità che un aa si sostitutisca ad un altro durante l evoluzione). Si ottengono con metodi statistici assegnando a ciascuna coppia un valore che riflette la frequenza con cui l uno si sostituisce all altro in famiglie di proteine omologhe. Di solito si utilizzano due tipi di matrici: 1) Matrici PAM 2) Matrici BLOSUM

28 Regole di scoring (proteine) Matrici PAM (Point Accepted Mutation) (M. Dayhoff 1978) Due sequenze sono definite ad 1PAM di distanza se per convertire l una nell altra, c è stata in media 1 mutazione accettata ogni 100 aa. Accettata = non ha cambiato la funzione della proteina o comunque non è stata letale per l organismo Per ottenere i valori da inserire nella matrice si utilizzano inizialmente sequenze molto simili: Poi da questi valori si estrapolano le frequenze attese per seq. più divergenti. Utilizzando tante coppie di sequenze ad 1 PAM di distanza, ci aspettiamo solo l 1% di differenze: a questo punto ricaviamo le frequenze di sostituzione attese di ciascuna coppia di aa. Abbiamo così costruito la matrice PAM1.

29 Regole di scoring (proteine) Se due sequenze sono filogeneticamente distanti è opportuno usare matrici PAM con indici più alti, e viceversa. Le matrici PAM si possono costruire in maniera iterativa e classificare: PAM % identità % 99% 75% 60% 50% 25% 20%

30 Regole di scoring (proteine) Se due sequenze sono filogeneticamente distanti è opportuno usare matrici PAM con indici più alti, e viceversa. Le matrici PAM si possono costruire in maniera iterativa e classificare: PAM % identità % 99% 75% 60% 50% 25% 20%

31 Regole di scoring (proteine) Matrici BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrices) (Henikoff and Henikoff 1992) Derivano dalla banca dati BLOCKS contenente gli allineamenti delle regioni più conservate di famiglie di proteine. Per ogni tipo di matrice BLOSUM si eliminano tutte le sequenze che hanno una percentuale di identità superiore ad una soglia. BLOSUM62 = derivata da un allineamento in cui le sequenze che abbiano più del 62% di amminoacidi identici vengono considerate come identiche

32 Regole di scoring (proteine) Matrici BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrices) (Henikoff and Henikoff 1992) Derivano dalla banca dati BLOCKS contenente gli allineamenti delle regioni più conservate di famiglie di proteine. Blosum6 Per ogni tipo di matrice BLOSUM si eliminano tutte le sequenze2 che hanno una percentuale di identità superiore ad una soglia. BLOSUM62 = derivata da un allineamento in cui le sequenze che abbiano più del 62% di amminoacidi identici vengono considerate come identiche

33 Regole di scoring (proteine) L utilizzo della matrice di similarita appropriata per ciascuna analisi e importante per avere buoni risultati negli allineamenti. poco divergenti molto divergenti BLOSUM80 BLOSUM62 BLOSUM45 PAM1 PAM120 PAM250

34 Allineamenti multipli Una estensione immediata dell allineamento a coppie è quello di estendere la procedura a N > 2 sequenze. GTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC GTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC RIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl RIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKTRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl RIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV IHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTNN

35 Allineamenti multipli Un allineamento multiplo si costruisce usando in maniera ricorsiva algoritmi simili a quelli usati per gli allineamenti a coppie ancora più calcoli dell allineamento pairwise!!! Si ottengono prima tutti i possibili allineamenti di coppia e si registra il punteggio di ciascuno. Si selezionano le sequenze più simili tra loro formando quindi clusters di sequenze allineate (costituiti da 2 o più sequenze il cui allineamento sia stato precedentemente fissato) Poi si continua aggiungendo le altre sequenze al cluster precedentemente ottenuto e così via fino ad includere tutte le sequenze considerate.

36 BLAST e CLUSTALW

37 Software per allineamenti In pratica, nel momento in cui ho bisogno di eseguire un allineamento di sequenze, ricerco un opportuno software che risolva il mio problema. seq1 seq2 seq DB tool allineamento similarità di sequenza tool lista di proteine simili alla query

38 Software per allineamenti Nella maggioranza dei casi però non avrò a che fare con software che eseguono gli algoritmi di allineamento esatto visti in precedenza, ma con versione euristiche degli stessi maggiore velocità. Es: una tipica ricerca di similarità sul database delle sequenze dell NCBI, richiede l analisi di un numero di sequenze > e che cresce in continuazione in maniera esponenziale.

39 Software per allineamenti Sono state sviluppate moltissime tecniche per incrementare la velocità degli algoritmi di allineamento. Es. di un possibile trucco : scomposizione di query e target in k-mers Supponiamo di aver una stringa di query I Questa può essere separata in una serie di (overlapping) 8-mers: Idea: se ho una sequenza target l assenza di uno qualunque degli 8-mers implica che I # J prima di allineare due sequenze posso esplorare il loro contenuto di k-mers (seeds) e decidere velocemente se le sequenze possono (potenzialmente) essere molto simili. Se sì le allineo, altrimenti continuo.

40 Software per allineamenti Noi faremo esperienza con 2 software per allineamento: BLAST e CLUSTALW

41 BLAST BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool) è una suite di programmi sviluppata presso NCBI (Altschul et al., 1990) per l allineamento veloce di una sequenza query con database anche di grandi dimensioni e di identificare target con una precisa significanza statistica. BLAST usa un approccio euristico che approssima l algoritmo di SmithWaterman, dando dei risultati meno accurati ma in media almeno 50 volte più veloci non c'è la sicurezzza di ottenere il migliore allineamento.

42 BLAST The BLAST algorithm is a heuristic search method that seeks words of length W (default = 3 in blastp) that score at least T when aligned with the query and scored with a substitution matrix. Words in the database that score T or greater are extended in both directions in an attempt to fina a locally optimal ungapped alignment or HSP (high scoring pair) with a score of at least S or an E value lower than the specified threshold. HSPs that meet these criteria will be reported by BLAST, provided they do not exceed the cutoff value specified for number of descriptions and/or alignments to report.

43 NCBI BLAST

44 NCBI BLAST

45 NCBI BLAST

46 CLUSTALW

47 CLUSTALW

48 CLUSTALW

49 CLUSTALW