Regolazione allosterica

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1 Macromolecole Biologiche Biotecnologie applicate alla progettazione e sviluppo di molecole biologicamente attive A.A Modulo di Biologia Strutturale Regolazione allosterica Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Allosteria Proteine allosteriche - 2 o più siti di legame topologicamente distinti (in grado di legare substrati, inibitori, attivatori) che interagiscono in modo funzionale fra loro la formazione del legame di un ligando ad un sito altera le proprietà dell altro sito, in particolare la sua affinità per il secondo ligando cooperatività: - positiva: la modificazione aumenta la capacità di legame - negativa: la modificazione diminuisce la capacità di legame - effettori allosterici: 1) effettori allosterici omotropici: (il substrato è esso stesso effettore) 2) effettori allosterici eterotropici (effettore diverso da substrato) es: inibizione/attivazione a feed-back

3 Allosteria Proteine allosteriche - cinetica non obbedisce al modello di Michaelis-Menten k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 V MAX = k 2 [E] T velocità massima di una reazione (quando l enzima è totalmente nella forma ES ed [S] è elevata) Eq. di Michaelis-Menten v 0 = V MAX [S] K M + [S] iperbole rettangolare

4 Allosteria Proteine allosteriche - cinetica non obbedisce al modello di Michaelis-Menten v ([S]) sigmoidale v prop. [S] n con n>1 - a basse [S], un aumento di [S] causa solo un lieve incremento di velocità pochi siti sono occupati dal substrato ed essi hanno una bassa affinità per S - a più alte [S] si ha un drammatico incremento d velocità man mano che si lega S, aumenta l abilità dell enzima di legare S (cooperatività positiva) - ad alte [S] andamento asintottico raggiungimento saturazione (V MAX )

5 Allosteria Proteine allosteriche - gli effettori allosterici (attivatori/inibitori) alterano la velocità di reazione dell enzima attivatore: aumenta la velocità di reazione dell enzima diminuisce il carattere sigmoide della curva di saturazione inibitore: diminuisce la velocità di reazione dell enzima aumenta il carattere sigmoide della curva di saturazione Tali effettori operano sulla capacità di legare il substrato e quindi sulla K M lasciando alterata la V MAX (Sistemi K) Nel caso in cui l effettore cambi la V MAX si parla di Sistemi V

6 struttura polimerica Proteine allosteriche - le proteine ed enzimi allosterici possiedono una struttura polimerica o quaternaria - l interazione fra le subunità (interazioni deboli) è responsabile della cooperatività da substrato agenti denaturanti Allosteria - se sottoposti a blanda denaturazione, molti enzimi allosterici perdono le loro proprietà allosteriche da substrato pur mantenendo attività catalitica risposta bifasica a inibitori competitivi (inibitori che mimano il substrato) - a basse [S], l inibitore competitivo può aumentare le capacità dell enzima a legare substrato (agisce come un attivatore) - ad alte [S], l inibitore competitivo si comporta in modo normale rallentando la reazione

7 Allosteria Modelli di allosteria (1) modello concertato o simmetrico (Monod, Wyman, Changeux) (2) modello sequenziale (Koshland, Nemethy, Filmer) Modello simmetrico Premessa: proteina allosterica formata da subunità che esistono in 2 stati Stato R (rilassato) Stato T (teso)

8 Allosteria Modello simmetrico Assunzioni: - le subunità devono essere tutte nello stesso stato (R o T) - stato R: alta affinità per il substrato stato T: bassa affinità per il substrato k T >> k R - in assenza di ligandi i 2 stati sono in equilibrio (spostato verso T) T 0 R 0 Esempio: costante di equilibrio L = [T 0 ]/[R 0 ] = 10 4 (T 0 e S 0 in assenza di substrato S)

9 Allosteria Modello simmetrico Substrato S aggiunto a proteina allosterica all equilibrio: - legame prevalente a proteine in stato R - spostamento dell equilibrio verso R (diminuzione della concentrazione della proteina nello stato T) incremento dell affinità complessiva enzima-substrato cooperatività positiva da substrato

10 Allosteria Effettori allosterici eterotropici Modello simmetrico attivatore: si lega prevalentemente allo stato R spostamento dell equilibrio verso R (stato ad alta affinità per il substrato) diminuzione dell apparente stato di cooperatività (riduzione piede della sigmoide e tendenza della curva di saturazione a diventare iperbolica) inibitore: si lega prevalentemente allo stato T spostamento dell equilibrio verso T (stato a bassa affinità per il substrato) aumento del piede della sigmoide necessaria una quantità maggiore di substrato per raggiungere lo stesso grado di cooperazione

11 Allosteria Effettori allosterici eterotropici Modello simmetrico

12 Assunzione: Modello sequenziale - le subunità possono essere sia nello stato R o che nello stato T - equilibri complessi di cui l equilibrio tra le forme pure R e T sono un caso particolare (modello simmetrico) - il substrato S ha una influenza diretta sulla forma dell enzima S aggiunto a proteina allosterica (prevalentemente nello stato T 0 ): - adattamento indotto cioè il substrato entra nel sito attivo a causa di collisioni casuali e la subunità si sistema attorno al substrato per produrre un buon adattamento conversione nello stato R Allosteria

13 Allosteria Modello sequenziale - se il cambio T R in una subunità tende a spingere le altre subunità ad assumere la forma R cooperatività positiva - il cambio conformazionale propagato può avvenire prima che si leghi il nuovo substrato o rendere il processo di adattamento indotto più semplice - se il cambio T R in una subunità rende più difficile alle altre subunità la assunzione della forma R cooperatività negativa la cooperatività negativa non è spiegabile con il modello simmetrico (che dipende solo dalla legge d azione di massa tra le forme R e T) Effettori allosterici eterotropici attivatore: si lega in un sito dal substrato ma opera allo stesso modo inibitore: rende l enzima più rigido, rendendo più difficoltoso l adattamento indotto T R

14 Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina - Struttura (Kendrew, 1959, Mb di capodoglio) (prima struttura determinata col metodo dei raggi X) residui (proteina monomerica) -8α-eliche (A-H), sandwich 3-su-3 (BEF-AGH) - prototipo strutturale per le globine C D - gruppo eme legato in tasca idrofobica fra elica E ed F F A

15 Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per la Mioglobina (Mb): - legame reversibile di O 2 a Mb: reazione all equilibrio Mb + O 2 MbO 2 costante di dissociazione K = [Mb][O 2 ] [MbO 2 ] La dissociazione dell O 2 da Mb può essere caratterizzata mediante la sua saturazione frazionale Y O 2 [MbO YO 2 ] 2 = = [Mb] + [MbO 2 ] [O 2 ] K + [O 2 ] frazione di siti di legame di O 2 occupati essendo O 2 un gas po YO [O 2 ] come po 2 = 2 2 K + po po 2 = pressione parziale 2 (tensione ossigeno)

16 Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: YO 2 = po 2 K + po 2 iperbole rettangolare - la Mb ha una p 50 molto bassa (circa 2.8 torr) e quindi una alta affinità per l O 2 - la Mb deve essere in grado di catturare, nel citoplasma di cellule metabolicamente molto attive, l O 2 proveniente dal torrente circolatorio (po 2 circa 30 torr) ed essere in grado di rilasciarlo ai mitocondri (po 2 <4 torr) - alle po 2 fisiologiche nel sangue (100 torr arterie, 30 torr vene) Mb è sempre saturata (po 2 = 100 torr Y O2 = 0.97; po 2 = 30 torr Y O2 = 0.91) Mb molto efficace per favorire il passaggio di O 2 dai capillari alle cellule muscolari

17 Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina Eme: - deossimioglobina: Fe(II) fuori dal piano dell eme di nm (struttura a cupola) - ossimioglobina: Fe(II) fuori dal piano dell eme di nm - cambiamenti non rilevanti biologicamente per Mb ma fondamentali per la regolazione allosterica di Hb

18 Mioglobina ed Emoglobina Comportamento di ipotetiche proteine di trasporto dell O 2 dotate di curve di saturazione iperboliche - una proteina di trasporto che lega l O 2 in modo analogo alla Mb non può essere un efficiente trasportatore di O 2 nel sistema circolatorio

19 Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: - la curva sigmoide indica che Hb può trasportare più O 2 ai tessuti rispetto al caso iperbolico (a pari p 50 ) - pressione venosa = 30 torr YO 2 = 0.55 pressione arteriosa = 100 torr YO2 = differenza nella saturazione da O 2 come misura della capacità della Hb di rilasciare O 2 dai polmoni (alle po 2 degli alveoli) ai tessuti (alle po 2 dei capillari) : fattore 0.40 nella saturazione da O 2 (caso sigmoide) fattore 0.25 nella saturazione da O 2 (se la curva fosse iperbolica )

20 Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: - curva di legame di O 2 sigmoidale cooperatività fra i siti di legame - p 50 = 26 torr per Hb - inizialmente: la pendenza della curva dell affinità per l O 2 è bassa perché le subunità competono indipendentemente per il legame al primo O 2 p 50 - dopo: quando una molecola di O 2 si è legata ad una subunità, l affinità delle altre subunità aumenta e quindi aumenta la pendenza della curva

21 Cinetica di legame O 2 per Hb: Mioglobina ed Emoglobina in ogni sistema di legame, una curva sigmoide è indicativa di interazioni cooperative fra i siti di legame Hb + no 2 Hb(O 2 ) n n = numero O 2 legate in una singola tappa da Hb (cooperatività infinita) equazione di Hill YO 2 = (po 2 ) n (p 50 ) n + (po 2 ) n grado di saturazione di Hb in funzione di po 2 -n (costante di Hill) non integrale come parametro di cooperatività fra subunità nel legame di O 2 (piuttosto che numero di subunità in grado di legare O 2 in una singola tappa) relazione empirica per fittare i dati n = 1 iperbole (non-cooperatività) n > 1 cooperatività positiva (cioè il legame di O 2 aumenta l affinità di Hb per il legame di altro O 2 ) n < 1 cooperatività negativa (cioè il legame di O 2 riduce l affinità di Hb per il legame di altro O 2 )

22 Mioglobina ed Emoglobina Emoglobina Struttura: α 2 β 2 (tetramero) - dimero di protomeri αβ (simmetria C2) - pseudosimmetria binaria fra α e β (pseudosimmetria D2) - α e β evoluzionisticamente correlate fra loro e con Mb (stessa struttura, no elica D in α) - il legame dell O 2 altera la struttura del tetramero

23 Mioglobina ed Emoglobina α2 β1 α2 β1 β2 α1 β2 α1 deossi-hb ossi-hb il legame dell O 2 altera la struttura del tetramero: - cambiano i contatti α1-β2 e α2-β1 - rotazione 15 fra i 2 dimeri αβ avvicinamento subunità β - restrizione canale centrale contenente solvente (all interfaccia α1-α1 e β1-β1)

24 Stato T = deossi-hb (stato teso ) Stato R = ossi-hb (stato rilassato ) Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina il legame dell O 2 innesca una serie di movimenti coordinati che altera la struttura quaternaria iniziale e determina il passaggio T R la transizione T R consiste in una rotazione reciproca dei 2 dimeri αβ

25 Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina (1) stato T: Fe(II) fuori dal piano dell eme (0.06 nm) verso HisF8 (struttura a cupola) (2) si lega O 2 : modifica stato elettronico dell eme, si accorciano i legami Fe-N porfirina, si annulla la forma a cupola dell eme

26 Mioglobina ed Emoglobina Meccanismo di Perutz passaggio T R: - movimento di 0.6Å di HisF8 verso l eme - traslazione di ~ 1Å di tutta l elica F (per evitare interferenze steriche) - rotazione dell angolo FG

27 Mioglobina ed Emoglobina Meccanismo di Perutz (3) accoppiamento variazioni terziarie e riorganizzazione quaternaria modifiche all interfaccia α1-β2 e α2-β1 stato T: contatto His(97)FG4(β2) - Thr(41)C6(α1) stato R: contatto His(97)FG4(β2) - Thr(38)C3(α1) (un giro di elica prima) in entrambi i casi buon impaccamento protuberanze/scanalature

28 (4) modifiche ai residui C-terminali Meccanismo di Perutz stato T: Arg(141)α, His(146)β parte di reticolo di coppie ioniche intered intra-subunità che stabilizza lo stato T stato R: rottura coppie ioniche Mioglobina ed Emoglobina stato T

29 Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina - Hb nello stato T ha bassa affinità per O 2 (lunghezza dei legami Fe-N superiore di 0.1 Å rispetto a stato R) - a seguito del legame dell O 2 ad una subunità nello stato T, l atomo di Fe 2+ torna nel piano della porfirina (da 0.6 Å a 0.2 Å) - tale movimento si trascina dietro l elica F e modifica i tratti EF ed FG - tali movimenti sono trasmessi all interfaccia tra le subunità e determinano la rottura dei ponti salini al C-terminale - tutte le subunità vengono convertite simultaneamente nello stato R (alta affinità per O 2 ) indipendentemente dal fatto che O 2 sia ad esse legato - le subunità nello stato R ma non impegnate da O 2 hanno aumentato la loro affinità per O 2 in quanto nella conformazione corretta - nello stato T, l O 2 è accessibile solo ai gruppi eme delle subunità α (ma non le β) per ingombro sterico impedimento assente dopo la transizione T R

30 Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina - le subunità α e β sono così saldamente accoppiate che una modificazione della struttura terziaria in una subunità non può non influenzare la struttura quaternaria dell intera proteina - Hb ha solo 2 stati quaternari, T ed R: i contatti inter-subunità agiscono come interruttori binari - la mancata flessibilità alle interfacce α1-β1 e α2-β2 fa sì che la transizione T R avvenga simultaneamente alle interfacce α1-β2 e α2-β1 - esistono effettori allosterici: H +, CO 2, Cl -, BPG (D-2,3-bisfosfoglicerato)

31 Hb e allosteria Hb ed allosteria il legame di O 2 ad Hb esprime proprietà associate ad entrambi i modelli - la transizione quaternaria T R è concertata come nel modello simmetrico - il legame del ligando nello stato T determina modifiche alla struttura terziaria delle subunità, necessarie per la conversione nello stato R (come richiesto dal modello sequenziale)

32 Allosteria Fosfofruttochinasi (PFK) Reazione 3 della glicolisi fosforilazione del fruttosio-6-fosfato (F6P) a formare fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP) - attacco nucleofilico del gruppo C1-OH dell F6P sull atomo di fosforo γ elettrofilico del complesso Mg 2+ -ATP + H + - PFK opera in condizioni lontane dall equilibrio (rappresenta il punto di controllo maggiore della glicolisi

33 Allosteria - enzima tetramerico in 2 stati conformazionali R e T in equilibrio - ATP èsia substrato sia inibitore allosterico di PFK (2 siti di legame distinti) Fosfofruttochinasi Mg 2+ -ATP Mg 2+ -ADP - legame ATP (substrato): uguale efficienza di legame sia per stato T che R - legame ATP (inibitore): legame di ATP quasi solo in conformazione T F6P F6P - legame F6P: legame di preferenza in stato R Mg 2+ -ATP Mg 2+ -ADP 2 subunità dell enzima tetramerico (ulteriore asse binario verticale)

34 Allosteria Fosfofruttochinasi ad alta conc. l ATP agisce come inibitore allosterico di PFK legandosi allo stato T e spostando l equilibrio T R verso T (curva iperbolica curva sigmoidale) - gli attivatori AMP e ADP bilanciano l inibizione da ATP legandosi allo stato R (stabilizzandolo) e spostando l equilibrio T R verso R - alta [ATP] (bassa richiesta metabolica) PFK inibita - bassa [ATP], PFK non inibita sintesi ATP

35 Allosteria Fosfofruttochinasi - lo stato R di PFK viene stabilizzato dal legame del substrato F6P (Arg162 forma coppia ionica con gruppo fosforico di F6P) - stato R stato T srotolamento elica - nello stato T Arg162 è sostituita da Glu161 affinità diminuita del gruppo fosforico per lo stato T - srotolamento dell elica impedito dal legame dell attivatore ADP - legame di ATP (inibitore) possibile solo con elica srotolata (stato T)