Diversità tra i viventi

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1 Diversità tra i viventi Proprietà della VITA La CELLULA Classificazione dei viventi 1

2 Ciascun vivente nasce, cresce, genera dei figli a lui simili e muore. La nascita, la crescita, la generazione di figli e la morte rappresentano le più evidenti manifestazioni della vita. Perché un vivente può realizzare questi eventi? Tutti i viventi possiedono delle caratteristiche comuni 2

3 Le proprietà della vita (1/4) 1 Organizzazione particelle subatomiche atomo molecola organulo cellula tessuto organo apparato popolazione comunità ecosistema biosfera organismo Tutti i viventi sono formati da materia, organizzata in molecole, come i non viventi. La composizione chimica del vivente è, tuttavia, qualitativamente diversa rispetto a quella dell'ambiente che lo circonda. Le molecole dei viventi, inoltre, sono organizzate in "impalcature" che costituiscono sistemi altamente complessi. La vita è organizzata su più livelli di complessità crescente 3

4 Le proprietà della vita (2/4) 2 Capacità di trasformare materia ed energia Attraverso la nutrizione il cibo Per mantenere la loro particolare organizzazione i viventi devono assumere materia e spendere energia. L energia è indispensabile per trasformare la materia in strutture viventi. viene trasformato in materia vivente 4

5 Le proprietà della vita (3/4) 3 Capacità di rispondere agli stimoli Un vivente può muoversi per afferrare la preda, per sfuggire al pericolo, o, come nel caso delle piante, per inseguire la luce. Un vivente è inoltre in grado di trasformarsi per sopravvivere anche in condizioni avverse (evoluzione). Un vivente è in grado di reagire di fronte al pericolo e di adattarsi ai cambiamenti ambientali 4 Adattamento 5

6 Le proprietà della vita (4/4) 5 Capacità moltiplicarsi Qualsiasi organismo vivente è destinato presto o tardi a scomparire: con la riproduzione la vita passa da un individuo all altro, permettendo la perpetuazione della specie. La riproduzione consente di mantenere la vita nel tempo 6

7 La cellula : espressione minima della vita Tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule: è la cellula la più piccola porzione organizzata di materia che possiede le caratteristiche della vita. si autoregola scambia materia ed energia con l ambiente CELLULA si riproduce si può evolvere 7

8 La cellula procariota La cellula procariota è organizzata per garantire la sopravvivenza di organismi molto semplici, con minime richieste energetiche, e non risulta specializzata nel compiere funzioni particolari. Tutto il volume cellulare è occupato da un liquido di consistenza gelatinosa (il citoplasma), in cui sono immersi tuti i costituenti chimici della cellula, e dei piccoli organuli (ribosomi), deputati alla sintesi delle proteine. Il materiale genetico (DNA) si trova fluttuante nel citoplama, in una regione priva di una membrana che la delimiti (non esiste un nucleo vero e proprio). Esiste invece una struttura rigida di protezione e di contenimento, la parete cellulare, che la separa dall ambiente esterno. membrana cellulare regione nucleare citoplasma ribosomi parete cellulare 8

9 La cellula eucariota La cellula eucariota è un tipo di cellula molto più voluminosa e complessa della cellula procariota. Al suo interno lo spazio è organizzato in settori cui compete una certa funzione in modo da assicurarne la sopravvivenza e la riproduzione. Le diverse regioni all interno della cellula sono delimitate da membrane interne. In particolare, una membrana (membrana nucleare) delimita il nucleo, in cui si trova il materiale genetico (DNA) che presiede al controllo di tutte le attività della cellula stessa. La cellula eucariota possiede inoltre numerosi organuli, in alcuni dei quali hanno luogo i processi metabolici fondamentali : nei ribosomi, ad es.,avviene la sintesi delle proteine; i mitocondri sono la sede della respirazione cellulare mitocondri citoplasma membrana nucleare membrana cellulare Reticolo endoplasmatico con ribosomi nucleo 9

10 Tassonomia : livelli gerarchici La chiave della classificazione naturale del mondo vivente è la specie. Generi Famiglie Ordini Classi SPECIE Phyla Divisioni Linneo Riconoscere individui della stessa specie può risultare abbastanza complesso. Ecco una definizione di specie universalmente accettata: la specie rappresenta una categoria sistematica comprendente una o più popolazioni di individui con caratteri simili, in grado di accoppiarsi originando prole feconda. Varie specie con caratteristiche comuni vengono raggruppate in generi; a loro volta i generi possono essere riuniti tra loro per alcuni caratteri generali e raggruppati in famiglie; le famiglie in ordini; gli ordini in classi; le classi in tipi di phila per gli animali e divisioni per i vegetali; i phila/divisioni in regni. REGNI 10

11 PIANTE FUNGHI ANIMALI I cinque regni Organismi eucarioti pluricellulari ( differiscono principalmente per il modo di nutrirsi ) Il modello ad albero di Whittaker in cinque regni evidenzia l origine comune e la successiva evoluzione di tutte le forme viventi. Organismi eucarioti per lo più unicellulari PROTISTI MONERE Organismi unicellulari procarioti 11

12 Caratteristiche dei regni Regno Tipo cellula Nutrizione Num. cellule Monere Procariote Autotrofi e eterotrofi Protisti Eucariote Autotrofi e eterotrofi Unicellulari Principalmente unicellulari Funghi Eucariote Eterotrofi Principalmente pluricellulari Vegetali (Piante) Eucariote Autotrofi Pluricellulari Animali Eucariote Eterotrofi Pluricellulari 12

13 Coltura Cellulare Insieme di cellule mantenute in vitro, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita. 13

14 Coltura Cellulare 14

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16 Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi 16

17 Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calore rosso su fiamma Sterilizzazione al calore secco mediante l utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160 C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante l utilizzo dell autoclave a 121 C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo l uso 17

18 Laboratorio di Coltura Cellulare Spazio o area di lavoro Abbigliamento da laboratorio Reagenti colturali Vetreria e Plastica di laboratorio Cappa a flusso laminare 18

19 CAPPA A FLUSSO LAMINARE Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell operatore e dell ambiente 19

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21 Cappa a flusso laminare di classe II 21

22 Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull aria in uscita -Protezione totale dell operatore e dell ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico 22

23 Condizioni fisico-chimiche All interno dell organismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di ph, protezione, mantenimento della temperatura ) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo. Una volta che le cellule sono nel terreno di cultura, queste funzioni, oltre all ambiente di coltura, devono essere sostituite dallo strumento. 23

24 Condizioni fisico-chimiche ph Sistema tampone (NaHCO 3 ) Temperatura C 24

25 Condizioni fisico-chimiche Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell organismo vivente. Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37 C, per certi tipi di cellule l incubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30 C o 34 C. 25

26 Condizioni fisico-chimiche Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere costante il ph Il ph del terreno dipende generalmente dalla %CO 2 nell incubatore La concentrazione di CO 2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in funzione del contenuto di NaHCO 3 nel terreno utilizzato e del ph desiderato 26

27 Relazione tra [NaHCO3] e il ph 27

28 Condizioni fisico-chimiche In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al ph per avere un controllo visivo dello stato del ph durante la crescita. rosso-arancio a ph 7.3 Rosso Fenolo rosso-viola a ph alcalino giallo-arancio a ph acido 28

29 La pressione parziale (pco 2 ) di CO 2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pco 2 cellulare misurata all interno dei tessuti (35-45 mmhg, equivalgono al % di CO 2 ). Così l incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule. 29

30 Triturazione tessuto I frammenti vengono sottoposti all azione di agenti chelanti (EDTA,) o enzimi proteolitici (tripsina o collagenasi) che degradano la matrice del tessuto 30

31 Sospensione Cellulare Mista Approcci per separare i diversi tipi cellulari: proprietà fisiche capacità di adesione proprietà di legame con anticorpi specifici uso di terreni o condizioni di coltura selettivi 31

32 Tipi di Coltura di Cellule in vitro Coltura Primaria Coltura Secondaria 32

33 Coltura Primaria Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita) Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine 33

34 Ciclo vitale di Cellule Primarie 34

35 Linea Cellulare Continua Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie Svantaggi: non riproducono esattamente l ambiente fisiologico cellulare 35

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37 Coltura Primaria Coltura a breve termine Coltura a lungo termine < 10 duplicazioni duplicazioni 37

38 Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua > duplicazioni 38

39 Linea Cellulare Continua Capacità di crescere indipendentemente dall organismo da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre un anno Immortale 39

40 Le prime Linee Cellulari Continue 1952, Johns Hopkins University 1963, University of Ibadan HELA RAJI 40

41 Medium di Coltura I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio 41

42 Medium di Coltura Sali inorganici Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del ph dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di sodio 42

43 Medium di Coltura Vitamine Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche Biotina Pantotenato Acido folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12 43

44 Medium di Coltura Amminoacidi-isomeri L Alanina Arginina Asparagina Acido aspartico Cisteina Glutamina Acido glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina Necessari per la sintesi delle proteine 44

45 Medium di Coltura Zuccheri Glucosio Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio per le biosintesi 45

46 Medium di Coltura Il terreno base viene conservato a 4 C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento più comune delle colture cellulari) 46

47 SIERO Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS) 47

48 SIERO 48

49 Sistemi di Crescita ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi) Fenomeno che richiede l interazione di recettori di membrana con proteine adesive, adsorbite sulla superficie della piastra di coltura SOSPENSIONE: cellule di origine ematopoietica (che normalmente vivono in un mezzo fluido) 49

50 Distacco delle cellule in adesione Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca 2+ e il Mg 2+, indispensabili per l adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato 50

51 Protocollo di tripsinizzazione Lavare le cellule (2X) con PBS (phosphate buffered saline) Aggiungere un volume adeguato di tripsina (pre-riscaldata) Incubare a 37 C per almeno 3 min Neutralizzare la tripsina con medium completo di FBS ( che contiene inibitori della tripsina) 51

52 Protocollo di tripsinizzazione Trasferire la sospensione ina provetta e centrifugare 5 min per giri al min Aspirare il sovranatante Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule Distribuire nelle nuove piastre Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule fuori dall incubatore il minor tempo possibile 52

53 Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene: -materiale rigido con superficie lucida -buona resistenza chimica a soluzioni acquose -limitata resistenza a solventi -totale assenza di tossicità per le cellule in coltura -trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio -la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero) 53

54 Efficienza di semina -Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente -Regola generale: densità > 10 4 cellule/cm 2 Tempo di duplicazione -La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione -Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea cellulare: circa ore per le cellule animali e ore per le cellule umane 54

55 Piastre 55

56 Tipi di Piastre Diametro (mm) Superficie (cm 2 ) Volume (ml)

57 Multi-well 57

58 Tipi di Multi-well Multi-well Superficie (cm 2 ) Volume (ml) ,32 1,0 0,1-0,2 0,3-0, ,88 3,83 0,5-1,2 1,0-2,4 6 9, ,0 58

59 Fiasche 59

60 Tipi di Fiasche Fiasche Superficie (cm 2 ) Volume (ml) T-25 T-75 T T T

61 microscopio a contrasto di fase: un diaframma anulare origina un cono di luce cavo. quando un raggio di luce colpisce un campione viene ritardata rispetto ad un raggio che non colpisce il campione i due raggi vengono rimessi in fase passando une lamina di fase e formeranno un'immagine definita 61

62 FIBROBLASTI microscopio a contrasto di fase (400X) 62

63 Coltura primaria in confluenza alla fine della seconda settimana 63

64 Conta Cellulare Diversi metodi: un metodo semplice ed economico è l uso dell emocitometro o camera di Burker -La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente. 64

65 Procedura per Conta Cellulare Prima del conteggio si devono staccare le cellule dalla piastra e eliminare gli aggregati cellulari mediante trattamento enzimatico o chimico (es. tripsina, EDTA). La conta del numero di cellule in genere si effettua con la camera di Burker. Questa è costituita da un vetro spesso, in cui è ricavata una camera capillare, la parete superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato da due graffe laterali. Al microscopio diventano evidenti una serie di linee ortogonali tra loro, che definiscono una serie di aree e, quindi, di volumi. 65

66 Protocollo di Conta Cellulare Per effettuare il conteggio: dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato un dato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti nei quadrati delimitati da una doppia barra e quelle presenti su due lati dello stesso quadrato (non si contano, invece, quelle su gli altri due lati). Si ripete la conta per almeno tre quadrati, si fa una media del numero di cellule contate e si ricava il numero totale di cellule moltiplicando il numero ottenuto per 25x104; si corregge poi per il volume totale della sospensione (il numero che si ottiene è riferito, altrimenti, ad 1ml). 66

67 Numero di cellule -La sospensione cellulare viene risospesa in egual volume di Trypan blue -La sospensione viene fatta scorrere per capillarità all interno della cameretta -Si contano le cellule non colorate e quelle colorate 67

68 Percentuale di Vitalità -Il trypan blue è in grado di colorare le cellule necrotiche -Percentuale di vitalità: N cellule vitali/n cell. non vitali + cellule vitali X 100 Concentrazione Cellulare N cellule vitali (media dei 3 quadrati) X X 2 68