Cellule Staminali e Clonazione (terapeutica)

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1 Cellule Staminali e Clonazione (terapeutica) Arti Ahluwalia Percentage of papers dedicated to stem cells in the journal Tissue Engineering, since its inception in By the end of this decade, 50% of all papers in regenerative medicine will probably focus on the use of stem cells. 1

2 Le Proprietà di cellule staminali Capacita di auto rinnovarsi (self-renewal) Capacità di differenziarsi lungo almeno una linea The cell which results from the fertilisation of an egg by a sperm has the capacity to form an entire organism (a person). This cell is TOTIPOTENT, and in the first few hours of division can produce other similar totipotent cells (TWINS TRIPLETS). After about 4 days, the cell divides into other cells which are not totipotent, but can become organs. These are known as embryonic stem cells (PLUIRPOTENT). 2

3 Stem Cells In teoria possono subire un numero infinito di divsioni (cioè è immortale*) e possono differenziarsi per diventare altre cellule specializzate. Il progenitore non è immortale. Nell adulto sono state trovate nella pelle, sangue, cornea, denti, intestini. Anche nel cervello e nel fegato (forse).. Qundi possono essere Unipotente Multipotente Pluripotente Totipotente Embryonic Properties: self renewal, differentiate 3

4 La potenza Cellula unipotente: si definisce unipotente una cellula staminale che dà origine ad un progenitore il quale, dopo la sua attività proliferativa, genera un solo tipo cellulare. Il prototipo di questo tipo cellulare è la cellula staminale dell epidermide, che genera solo i cheratinociti della nostra pelle. ( In realtà si è visto che c è almeno una componente di cellule staminali nella parete del follicolo pilifero, che può dare origine a tutte le componenti del pelo, ma anche alle cellule dell epidermide) Cellula multipotente: il prototipo della cellula staminale multipotente o pluripotente è la cellula staminale ematopoietica, che dà origine alla la serie linfatica (linfociti T, B e natural killer), ai globuli rossi, alle piastrine, ai granulociti (neutrofili, eosinofili, basofili). La cellula staminale ematopoietica origina quindi tutte le cellule del sangue e anche cellule con capacità fagocitarie che si trovano ubiquitariamente nei tessuti. Cellula pluripotente:potenzialmente sono in grado di generare progenitori per tutti i tipi di cellule. Sono di questo tipo le cellule staminali embrionali (nella blastocisti) capaci di formare tutti i tessuti dell organismo. Cellula totipotente:sono in grado di formare organismi interi. Si parla di cellule che hanno perso la potenza... Modi di divsione dalla cellule staminali Succesione clonale: nella niccha ci sono cellule quiescienti che vengono svegliate solo in caso di necessità. Quando vengono stimolate (da ferite ecc), alcuni si divdono producendo un numero elevato di cellule differenziate. Pero la cellula iniziale non viene rinnovata Nicchia: il stemness viene perso quando esce dalla nicchia 4

5 Modello deterministico: Quando entra in azione la cellula produce due figlie di cui una rimane staminale. Cellula staminale Cellula staminale Cellula progenitrice Cellule differenziate Modello Stochastico: La divisione della cellula staminale puo dare luogo a due figlie staminali, o nessua, o una, a secondo del bisogno Cellula staminale Cellula staminale Cellula staminale Cellula staminale 2 Cellula staminale Cellula progenitrice Cellula staminale Cellule differenziate Cellule differenziate 1 0 5

6 Quello che succedera forse dipende da fattori esterni Immortalità e sensecenza Sembra comunque che la C. Staminale non può sopravivere più di 130 anni. Cose che invecchia, la cellula o il suo microambiente? Che ruolo hanno le C. Staminali nella regenerazione e riparo? C.Staminali da animali vecchi hanno lo stesso effetto di quelli giovani quando impiantati in animali giovani. E in animale giovani cosa succede? 6

7 Il limite di Hayflick Zona logaritmica Limite di Hayflick Animale eta H topo ½ 20 Pollo Uomo Tartaruga Eta specie 7

8 telomeri La senescenza è dovuta in grande/piccola parte ai telomeri. Parte terminale dei cromosomi, diventa piu piccola dopo ogni duplicazione Da 9-11 kbp, quando diventa 5-6 kbp la divisione cellulare diventa instabile Ci sono enzimi telomerasi che riparano la parte terminale dopo ogni divisione Si trovano nelle cellule germinale, nelle cellule tumorali, e anche (ma con bassa attività) nelle cellule staminali ematopoetiche Vecchie cellule staminalivecchio tessuto, le cs invecchiano perche sono sempre attive Invecchiamento dovuto al microambiente (perche le CS non invecchiano) 8

9 Si traduce in quante C,S si sono? Il differenziamento La diversità tra una cellula staminale e un progenitore da un punto di vista molecolare risiede nell espressione differenziale di geni. Considerando che il genoma della cellula staminale e del progenitore sono identici tra loro, le due cellule si distinguono solo in modo funzionale, cioè per il loro fenotipo, cioè per la loro espressione L espressione differenziale o meglio la trascrizione differenziale dei geni è regolata da tre meccanismi: 1) La localizzazione o segregazione di determinanti citoplasmatici 2) L induzione da parte di segnali provenienti da altre cellule o tra le cellule figlie, o il microambiente, la nicchia* 3) L apoptosi (morte naturale cellulare) 9

10 Dove si trovano negli embrioni nelle prime fasi di sviluppo (blastocisti) ottenuti mediante fecondazione in vitro per il trattamento dell infertilità o specificatamente a scopo di ricerca (cellule staminali embrionali) negli pseudo-embrioni creati inserendo il nucleo di una cellula somatica adulta (staminale o meno) in una cellula uovo privata del proprio nucleo (cellule staminali embrionali clonate) (cioe Dolly) nelle cellule derivate da feti (cellule staminali fetali) nel sangue dei vasi del cordone ombelicale (cellule staminali fetali) nei tessuti adulti (cellule staminali adulte) Cellule Staminali dal midollo osseo Adult stem cells can be obtained from bone marrow (main source:pelvic bone). Hematopoietic cells : everything in blood, RBC, etc Mesenchymal: bone, cartilage, muscle, stroma, tendon, connective tissue (dermis, adipocytes ets) The marrow is seperated by allowing cells to settle 10

11 What do they look like? Bone marrow hematopoietic cells Have known surface markers (CD34), small and spherical. High nuclear to cytoplasmic ratio. 1/ Rarely divide. 11

12 Provenienza e tipi di cellule staminali adulte del midollo osseo. What is new: IPSC Differentiated cells can be reprogrammed to an embryonic-like state by transfer of nuclear contents into oocytes or by fusion with embryonic stem (ES) cells. Little is known about factors that induce this reprogramming. Here, we demonstrate induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic or adult fibroblasts by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, c- Myc, and Klf4, under ES cell culture conditions. Unexpectedly, Nanog was dispensable. These cells, which we designated ips (induced pluripotent stem) cells, exhibit the morphology and growth properties of ES cells and express ES cell marker genes. Subcutaneous transplantation of ips cells into nude mice resulted in tumors containing a variety of tissues from all three germ layers. Following injection into blastocysts, ips cells contributed to mouse embryonic development. These data demonstrate that pluripotent stem cells can be directly generated from fibroblast cultures by the addition of only a few defined factors. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell

13 STEM CELL: debate, neural stem cells and plasticity. Only cells of the hemopoietic system Plasticity: eg hematopoietic SCs Skin, liver etc Plasticità e Transdifferenziamento Transdifferenziamento: è un processo biologico definito come l abilità di c. Staminali di attraversare barrriere definite dalle mappe embrionali (lineage barriers) e adottare profili di espressione e fenotipo funzionale diverse. Abbastanza dibattuto anche adesso.. Pero, è compatibile con l ipotesi che stemness è uno stato anziche un specifico tipo di cellula. Lo stemness infatti puo essere indotta se alle cellule viene fornito l ambiente giusto. Sembre che sia piu le proprietà della nicchia (eg nicchia nel midollo) che mantengono stemness e determinano la linea che adottano. Zipori, D. (2005) The stem cell state: plasticity is essential, whereas self-renewal and hierarchy are optional. Stem Cells 23, La maggiore parte degli exp sono stati fatti su non mamifferi e topi nudi. Si va a indurre stati non fisiologici 13

14 Si chiama crossing over of lineages 14

15 Cellule Staminali Embrioniche Celluel Staminali Pluripontenti sono state isolate da embrioni umane (cliniche IVF). Sono in grado di produrre cellule differenziate. Cellule Pluripotenti sono state derivate da feti abortiti La clonazione Riproduttiva SCNT- Somatic cell nuclear transfer o come hanno fatto Dolly (somatic cell nuclear transfer (SCNT) ) An animal egg cell is isolated, and its nucleus is removed. What remains is the environment necessary to develop an embryo. Then, a somatic cell (just means a diploid cell which is not an egg or sperm) is placed near the eggs cell, and the 2 cells fuse together. The resulting fused cell has the potential to from an entire organism, so it is TOTIPOTENT. When placed in a uterus, it can develop into a complete organism which has the same genes as the somatic cell. 15

16 Prime fasi dell embriogenesi. La cellula ibrida va messa nel punto giusto del ciclo di ovulazione Questa tecnica era conosciuta da anni. Si usava tecniche molto invasive per togliere il nulceo dall uovo e sostiturelo con il nulceo somatico 16

17 Dolly invece è stata il primo mammifero (1997, Wilmut et al). Dolly è morta prematuramente nel Dopo questo sono stati clonati i topi, i ratti, le capre, le mucche e i maiali. Nella clonazione riproduttiva, si tratta di creare un nuovo animale partendo dal nucleo di un donatore. a) l efficienza di questo processo è inferiore all 1%, cioè bisogna produrre più di 100 embrioni per averne uno che nasca quindi economicamente sarebbe un disastro e b) questi animali hanno spesso malformazioni e problemi che ne compromettono la salute. Nella grande maggioranza dei casi gli animali che sopravvivono alla gravidanza, hanno gravi malformazioni: i feti sono più grandi, hanno dei problemi soprattutto cardiaci, renali ed osteo-articolari che ne compromettono la longevità. La clonazione riproduttiva UMANA è vietata in quasi tutti i paesi. La clonazione riproduttiva UMANA è vietata in quasi tutti i paesi.? 17

18 Dolly: before the creation of Dolly, researchers had been unable to perform SCNT in mammals, although the technique was used for cloning insects and amphibians. What was the break through? How was the egg deprived of the nucleus and then bequeathed with a different nucleus. Why do they say Dolly was old? Telomers were 80% shorter. Everytime DNA is replicated, its length is shortend by about bp.(why?) (mechanism underlying the Hayflick limit) Germ cells (and cancer cells and some stem cells) have an enzyme called telomerase which rebuilds telomers. Clonazione terapeutica 18

19 Clonazione terapeutica: la creazione di popolazioni di cellule staminali pluripotenti e multipotenti si isolano cellule somatiche dal paziente si preleva il nucleo da una cellula somatica(si fa a mano sotto microscopio) il nucleo viene inserito in una cellula uovo enucleata si ha così la formazione di una cellula pre-embrionale contenente solo il DNA del paziente (sempre a mano) si interrompe la crescita al livello di blastocisti si isolano e coltivano le cellule staminali si utilizzano queste cellule per ricreare tessuti totalmente compatibili con il ricevente Cellule molto sensibile ad ogni stimolo esterno: durante la fase espansiva vi è il rischio di differenziazione cellulare, difficoltà nel trasporto delle cellule nel tessuto da trattare (solo per il sangue risulta semplice) e inoltre quando impiantate, le cellule staminali entrano in competizione per lo spazio a disposizione con le cellule residenti nel tessuto; vi è inoltre il rischio che non differenzino nelle cellule desiderate, spesso infatti tendono a dare origine a fibroblasti. Inoltre c è un po di DNA nei mitocondri che non viene trasferita. Nella maggiore parte dei casi il DNA diventa caotico. Al momentonon è una prospettiva immediata della clinica di nessun paese, ma in molti paesi si studiano in modo molto intenso queste cellule per capire se funzionano, se si possono prevenire i tumori, e in quali tessuti possono essere fatte differenziare. Prime fasi dell embriogenesi. Intorno al 6-7 giorno si forma la blastocisti dalla quale nascono i tre foglietti embrionali (mesoderma, ectoderma e endoderma) dai quali si sviluppano tutti i tessuti che compongono un organismo adulto. 19

20 In Europe there are many differences in cloning laws. In the UK: experiments on embryos less than 14 days old are allowed. SCNT is legal for research. The rest of Europe has signed an agreement which bans the use of embryos for research. But France, Germany and the UK have not signed as yet. Cloning is permitted in France for therapeutic purposes. However recently the EC decided that research can be carried out as long as no human embryos are destroyed. This is open to interpretation. Until 2001, in the US government funds could not be used for research on human embryos (Now some lines are available). However private institutions could carry out unrestricted research. Now HES research os funded by the NIH As far as the rest of the world is concerned, it is difficult to know what happens in laboratories.even in many developed countries there are no laws (Israel, India). There is a UN proposal banning human cloning (no one signed it). 20

21 I problemi Etici Source Mantenere stemness Controllare differenziamento POI C E TEMPO 21

22 Gli stimoli 22

23 Cose la differenza tra clonazione riproduttiva, terapia con la HES, e clonazione terapeutica? Cose una nicchia staminale e quali sono le caratteristiche della nicchia? Le MSC 23