Role of ECF σ factors in stress response of Bradyrhizobium japonicum

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1 Research Collection Doctoral Thesis Role of ECF σ factors in stress response of Bradyrhizobium japonicum Author(s): Masloboeva, Nadezda Publication Date: 2012 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 DISS. ETH No Role of ECF factors in stress response of Bradyrhizobium japonicum A dissertation submitted to the ETH Zurich for the degree of DOCTOR OF SCIENCES presented by NADEZDA MASLOBOEVA Dipl. Biol., Novosibirsk State University born October 23, 1985 citizen of the Russian Federation Prof. Dr. Hans-Martin Fischer, examiner Prof. Dr. Hauke Hennecke, co-examiner Prof. Dr. Julia Vorholt, co-examiner Prof. Dr. Justine Collier, co-examiner 2012

3 THESIS SUMMARY Living organisms including bacteria are constantly challenged by changes in environmental conditions. Bacteria adapt to these fluctuations by altering gene expression using a wide set of regulatory mechanisms. One of the possible ways to achieve coordinated expression of entire sets of genes is the use of alternative factors which determine promoter specificity of the RNA polymerase (RNAP) holoenzyme. Extracytoplasmic function (ECF) σ factors belong to this class of regulators. They are required for RNAP to recognize promoters associated with genes which are involved in many different tasks, including stress responses, metal homeostasis, virulence-related traits, and maintenance of cell envelope structure. The genome of Bradyrhizobium japonicum, the nitrogen-fixing soybean endosymbiont, encodes 17 predicted ECF factors. This work aimed at unraveling the functions of ECF factors in B. japonicum, identifying mechanisms regulating their activity, and their target genes. The first part of this thesis deals with the oxidative stress response of B. japonicum and the role played by two ECF factors, EcfQ and EcfF, in this process. Mutant analysis showed that both factors are required for tolerance to singlet oxygen under free-living conditions but not for an effective symbiosis. Potential target genes of EcfQ and EcfF were determined by microarray analyses. These data disclosed that each of the two ECF factors controls a distinct, rather small set of genes. While functions of the genes within the EcfQ-regulon are largely unknown, EcfF directs transcription of a group of three methionine sulfoxide reductase genes. Moreover, the activity of each of these factors is controlled by different mechanisms. We show that EcfF is auto-regulated via an EcfF-dependent promoter and negatively regulated via interaction with its cognate anti- factor OsrA whose gene is cotranscribed with ecff. In this work, two cysteine residues required for proper function of OsrA were identified. Expression of ecfq and genes coding for paralogous class-33 ECF factors, to which EcfF belongs, is probably controlled by an as yet unidentified transcription factor because putative promoter regions of these genes share a remarkable degree of sequence similarity. Since no cognate anti- factor gene is associated with ecfq, the mechanism(s) regulating EcfQ activity remains unclear. The second part of this work is dedicated to the further characterization of the general stress response in B. japonicum. As shown in previous studies, and similar to other - 1

4 Thesis summary proteobacteria, the general stress response in B. japonicum involves ECF factor EcfG controlled by a partner-switching mechanism involving the anti- factor NepR and the antianti- factor PhyR. Using deletion mutants and phenotypic assays, it was shown that PhyR and EcfG are required for stress responses and symbiotic interactions with various host plants. Microarray analysis revealed that PhyR and EcfG control highly congruent regulons with a large portion of genes of unknown function. In this work, we deleted a cluster of five functionally undefined genes which are organized in two divergently oriented operons, bll and blr , and transcribed in an EcfG-dependent manner. The resulting mutant strain is more sensitive to elevated temperature and UV exposure than the wild type, yet still symbiotically proficient. Thus the PhyR/EcfG regulon probably can be subdivided in genes whose products are crucial for free-living stress conditions, symbiosis or both. Finally, analysis of a putative histidine kinase, Blr1461, which might be involved in PhyR-/NepRmediated signalling to EcfG is described. However, repeated attempts to construct a deletion mutant in the blr1461 gene were unsuccessful, implying that Blr1461 might be an essential protein. Attempts to document autophosphorylation of purified Blr1461 variants have failed, rendering its function as a kinase questionable. 2

5 RIASSUNTO DELLA TESI Gli organismi viventi, batteri inclusi, sono costantemente sottoposti a cambiamenti delle condizioni ambientali. I batteri si adattano a queste variazioni usando una serie di proteine regolatrici che alterano l espressione genica. L uso di fattori alternativi, determinanti la specificità dell oloenzima RNAP per un promotore, è uno dei possibili modi per ottenere il coordinamento nell espressione di un intero set di geni. I fattori con funzione extracitoplasmatica (ECF) appartengono a questo tipo di regolatori, e sono necessari per la trascrizione di geni coinvolti in svariati processi, come risposta allo stress, omeostasi dei metalli, virulenza e mantenimento del rivestimento cellulare. Nel genoma di Bradyrhizobium japonicum, l azoto-fissatore endosimbionte della soia, sono codificati 17 possibili fattori ECF. Lo scopo di questo lavoro è la determinazione della funzione di fattori ECF, l identificazione dei meccanismi che ne controllano l attività e l individuazione dei loro bersagli genici in B. japonicum. L oggetto della prima parte di questa tesi è la risposta allo stress ossidativo da parte di B. japonicum e il ruolo ricoperto da due fattori ECF: EcfQ e EcfF. L analisi di ceppi mutanti per questi geni ha rilevato che entrambi i fattori sono necessari per la resistenza all ossigeno singoletto, ma non durante la simbiosi. I bersagli di EcfQ e EcfF sono stati identificati tramite microarray. Entrambi i fattori controllano un distinto e piuttosto limitato set di geni, per la maggior parte a funzione ignota per quanto riguarda il regolone di EcfQ. Al contrario, EcfF controlla la trascrizione di un ipotetico sistema di metionina solfossido reduttasi. Inoltre la funzione dei due fattori è modulata da meccanismi differenti. EcfF è sia autoregolato che negativamente regolato dall interazione con l anti-fattore OsrA, il cui gene è co-trascritto con ecff. La funzionalità di OsrA dipende da due cisteine, identificate in questo studio. Diversamente, l espressione di ecfq e di altri geni codificanti fattori ECF di classe 33 (alla quale appartiene anche EcfF) è verosimilmente controllata da un fattore di trascrizione ignoto, dal momento in cui la putativa regione del promotore di questi geni è marcatamente conservata. Poiché non vi è un anti-fattore geneticamente associato a ecfq, il suo meccanismo di regolazione resta ignoto. La seconda parte di questo lavoro riguarda un ulteriore caratterizzazione della risposta allo stress generale da parte di B. japonicum. Come indicato in precedenza, la risposta allo stress 3

6 Riassunto della tesi generale in quest organismo, così come in altri -proteobatteri, include il fattore ECF EcfG, la cui attività è controllata dall anti-fattore NepR e dall anti-anti-fattore PhyR. Tramite lo studio di ceppi mutanti e saggi fenotipici è stato possibile dimostrare che PhyR e EcfG sono necessari per la risposta allo stress e per lo sviluppo della simbiosi con diverse piante. I regoloni di PhyR e EcfG, analizzati attraverso microarray, sono sovrapponibili e includono molti geni a funzione ignota. Un cluster di cinque geni organizzati in due operoni con orientamento opposto e appartenente al regolone condiviso, bll/r , è stato selezionato per una mutagenesi. Il ceppo mutante si è rilevato più sensibile al caldo e ai raggi UV del wild type, ma comunque simbioticamente attivo. Il regolone PhyR/EcfG può dunque essere suddiviso in geni coinvolti nella resistenza allo stress in assenza di simbiosi, nella simbiosi o in entrambi i casi. Per finire, è riportata l analisi di una putativa istidina chinasi, Blr1461, probabilmente coinvolta nella modulazione di EcfG mediata da PhyR/NepR. Diversi tentativi di creare un mutante di delezione per questo gene sono falliti, suggerendone l essenzialità. Inoltre esperimenti mirati alla documentazione di una possibile autofosforilazione di Blr1461 hanno avuto esito negativo, indicando una possibile funzione alternativa della proteina. 4