D'Addario - Biologia Molecolare

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1 2. Struttura del DNA contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale gli acidi nucleici, acido desossiribonucleico (DNA) ed acido ribonucleico (RNA), depositari dell informazione genetica sono costituiti da NUCLEOTIDI La struttura di ogni proteina è il prodotto di un informazione programmata della sequenza nucleotidica degli acidi nucleici in una cellula La CONSERVAZIONE e la TRASMISSIONE dell informazione genetica sono l unica FUNZIONE nota del DNA 1

2 Il DNA è un polimero I suoi monomeri sono i NUCLEOTIDI I nucleotidi sono formati da: - Gruppo fosfato - zucchero deossiribosio BASE AZOTATA - base azotata Gruppo fosfato zucchero Basi Eterocicliche Le basi eterocicliche presenti negli acidi nucleici appartengono a due classi: Pirimidina + imidazolo 2

3 Le BASI AZOTATE Adenina, guanina, citosina e timina si trovano nel DNA Adenina, guanina, citosina e uracile si trovano nell RNA Monosaccaridi degli Acidi Nucleici Gli zuccheri presen= negli acidi nucleici sono 2- deossi- D- ribosio (DNA) e D- ribosio (RNA) 3

4 DNA vs RNA I NUCLEOSIDI = BASE + ZUCCHERO Legame b- glicosidico Ribosio Ribonucleosidi Desossiribosio Deossi- ribonucleosidi 4

5 Nucleosidi Il legame tra basi eterocicliche e ribosio forma i diversi Nucleosidi Il legame è di 9po β- N- glicosidico tra il Carbonio anomerico (C1) del ribosio e l N9 delle purine o N1 delle pirimidine Il legame può avere due orientazioni: Syn e An9. An9 è predominante Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in acqua. Sono facilmente idrolizzabili da soluzione acquose di acidi. syn 9 1 an= 5

6 Nucleo=di I nucleo9di sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi. Il sito di fosforilazione è spesso l ossidrile al 5 del ribosio (ma può essere anche quello in 3 ) Possono essere mono- di- e tri- fosfa9 (Es.: TMP, TDP, TTP.) I di- e tri- fosfa9 sono lega9 da legame anidridico, stabile e ad alta energia TMP O O -P O O O O -P O O O O -P O O FOSFATO C C Nucleotide O C Base azotata C C O deossiribosio 6

7 AMP, ADP e ATP Legame estereo Legame fosfoanidridico Legami fosfoanidridici Nomenclatura + deossiriboso (riboso) + fosfato Tabella 2.1 Basi, nucleosidi e nucleo=di. 7

8 Funzioni dei nucleo=di Unità struqurali degli acidi nucleici Deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (ATP - GTP) Mediatore di processi cellulari (camp) Parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA ) Intermedi di reazioni sinte9che (S- Adenosilme9onina) Le strutture del DNA struttura primaria del DNA è la sequenza di nucleotidi che costituiscono la molecola struttura secondaria è la configurazione tridimensionale stabile di una molecola di DNA struttura terziaria è il complesso ripiegamento cui il DNA genomico è soggetto all interno di una cellula 8

9 STRUTTURA PRIMARIA del DNA Sintesi DNA - Formazione del legame fosfodiestarico 9

10 Lo scheletro della catena polinucleotidica è formato da residui di zucchero e di fosfato alternati. La posizione 3 di uno zucchero è legata alla posizione 5 dello zucchero successivo mediante un gruppo fosfato. Le basi azotate sporgono fuori dallo scheletro. Il legame fosfodiesterico crea impalcatura ripetitiva zucchero- fosfato: è una caratteristica strutturale del DNA COSTANTE L ordine delle basi lungo la catena è invece CASUALE I legami fosfodiesterici conferiscono una ben definita polarità alla catena del DNA 10

11 Le catene di DNA hanno una estremità detta 5 ed un altra estremità detta 3 5 = carbonio dello zucchero a cui è attaccato il gruppo funzionale fosfato 3 = carbonio dello zucchero a cui è attaccato il gruppo funzionale ossidrile STRUTTURA SECONDARIA 11

12 STRUTTURA SECONDARIA - modello Watson- Crick Una molecola di DNA è formata da due catene di nucleotidi appaiate secondo le regole della complementarietà: doppia elica Elica destrorsa cos9tuita da due catene polinucleo9diche an=parallele Le basi sono all interno dell elica allineate ad angolo reto con l asse dell elica Torsione Come si legano tra loro le basi?? 12

13 L Appaiamento delle Basi Ogni 9po di base presente su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare. 13

14 14

15 Tautomeria: condizione in cui una molecola si presenta sotto due diverse forme pur avendo lo stesso numero di atomi. nucleotidi alternativi: Tautomeria cheto- enolica della guanina forma chetonica forma enolica Tautomeria ammino- imminica della citosina Forme tautomeriche 15

16 Forme tautomeriche 16

17 NB legame H è importante nel determinare la specificità delle coppie di basi D D H2O 3 A A Incompatibilità della coppia A:C Non si formano appropriati legami idrogeno La coppia fra queste basi risulta instabile 17

18 Figura riportata nella pubblicazione originale di Watson e Crick Nature,

19 NB 1 ångström (Å) = 0,1 nm IMPILAMENTO DELLE BASI la disposizione delle basi all interno della doppia elica è energeticamente favorita NB Molecole contenenti anelli aromatici tendono a disporsi spontaneamente impilate basi azotate a ph neutro sono idrofobiche IN UNA CATENA NUCLEOTIDICA LE BASI SI IMPILANO DISPONENDOSI PARALLELAMENTE FRA DI LORO RIDUCE CONTATTO BASI CON H2O STABILIZZA LA STRUTTURA DEGLI AC. NUCLEICI Figura 2.18A Impilamento delle basi. 19

20 BASE FLIPPING Figura 2.18B Impilamento delle basi. 20

21 INTERAZIONI NON- COVALENTI STABILIZZANO DOPPIA ELICA DNA 1) forze di van der Waals (interazioni da IMPACCAMENTO fra le basi impilate, sono additive) 2) LEGAMI IDROGENO: tra le basi azotate appaiate di filamenti opposti 3) Effetti IDROFOBICI: escludendo molecole H2O dall impaccamento delle coppie di basi si rafforzano i legami H 4) Interazioni CARICA/CARICA: la repulsione elettrostatica fra le cariche negative dei gruppi fosfato è schermata dall interazione con ioni Mg2+ e proteine ricche di residui aa basici (Lys e Arg) Dato il diametro costante dell elica le basi su ogni catena saranno affacciate verso l interno e avranno limitate possibilità di combinazione una grossa base purinica si trova sempre di fronte a una piccola base pirimidinica IMPOSSIBILI le combinazioni purina- purina (troppo larga) pirimidina- pirimidina (troppo stretta). 21

22 Figura 2.17 Le proteine interagiscono generalmente con il solco maggiore del DNA. 22

23 Gruppi chimici delle basi espos= nel solco maggiore e nel solco minore del DNA. solco maggiore fornisce molte informazioni di tipo chimico codice basato sulla presenza di: - Accettore di legame idrogeno - Donatore di legame idrogeno - gruppo Metilico - Idrogeno (H) non polare G-C : AADH C-G : HDAA A-T : ADAM T-A : MADA Questa proprietà permettere alle proteine di riconoscere senza ambiguità specifiche sequenze di DNA senza che sia necessario aprire la doppia elica. DNA vs RNA 23

24 Perché il DNA contiene timina? Citosina si trasforma spontaneamente per deamminazione in Uracile enzimi di riparazione possono riconoscere queste "mutazioni" sostituendo uracili con citosine ma non possono distinguere uracili naturali da quelli mutati Quindi viene usata la.. TIMINA (5- metil- uracile) Regole di Chargaff (1950) Nel DNA la quantità di adenina (A) è sempre uguale alla quantità di timina (T) e la quantità di citosina (C) è sempre uguale alla quantità di guanina (G). Di conseguenza il quantitativo di basi puriniche (A+G) è sempre uguale al quantitativo di basi pirimidiniche (C+T). 24

25 caratteristico per ogni specie spesso utilizzato nella classificazione degli organismi Contenuto in G+C di alcuni genomi nucleari eucariotici modello delle isocore: il genoma vertebrati è un mosaico di segmenti di DNA (isocore) caratterizzati da una propria ed omogenea composizione in basi. 25

26 modello delle isocore: il genoma vertebrati è un mosaico di segmenti di DNA (isocore) con un omogeneo contenuto in G+C Nei vertebrati a sangue caldo (mammiferi, uccelli) si osservano 5 classi differenti si isocore: - L1 e L2: povere in GC (oltre il 60% del genoma) - H1, H2, H3: ricche in GC 26

27 Frazionamento composizionale Proprietà termiche del DNA 27

28 28

29 La denaturazione del DNA dipende da contenuto G+C e concentrazione salina DNA in sz a bassa conc di sali DNA in sz ad alta conc di sali Effetto del contenuto in GC su Tm 29

30 Effetto della concentrazione salina su Tm IL DNA DENATURATO PUÒ ESSERE RINATURATO 30

31 Manipolazione del DNA in vitro Inizio anni 50 Maurice Wilkins e Rosalind Franklin studiavano la struttura del DNA, utilizzando la diffrazione a raggi X 31

32 diffrazione ai raggi X del DNA - - fascio di raggi X, inviato al cristallo, viene deflesso dagli atomi e/o molecole del reticolo cristallino immagine dei raggi X viene registrata su una lastra fotografica che sta dietro il cristallo, dalla parte opposta rispetto alla sorgente dei raggi. dimostrarono che la molecola aveva una struttura ad elica (simile a quella che negli stessi anni era stata individuata nelle proteine) DIFFRAZIONE onde con λ simile attraversano struttura ordinata si ha INTERFERENZA: Se oscillazioni onde sono in fase: si rinforzano Se onde allineate con altra serie di onde: si annullano Onde attraversano linee orizzontali spot perpendicolari linee inclinate linee a zig zag 32

33 Immagine di diffrazione ai raggi X utilizzata da Watson e Crick Le scoperte della Franklin nel febbraio del 1953, scrisse che il Dna è composto da due catene distinte Un giro dell elica è lungo 34 Å (3.4 nm), con un diametro di ~20 Å (2 nm). Poiché la distanza tra nucleotidi adiacenti è 3.4 Å, ogni giro dell elica contiene circa 10 nucleotidi. 33

34 Francis Crick James Watson default.aspx Conformazioni del DNA 34

35 A- DNA B- DNA scoperta da Rich et al., 1979 al MIT Z- DNA polinucleotidi complementari che alternano purine a pirimidine ad alta concentrazione di sali es: poli d(gc) poli d(gc), poli d(ac) poli d(gt) Probabile anche in vivo elica sinistrorsa le basi assumono conformazioni alternate syn/anti. Guanidine in posizione syn la dorsale zucchero- fosfato segue un andamento a zig- zag. Major groove molto superficiale e minor molto stretto. 35

36 Posizioni della deossiguanosina nel DNA. forma A forma Z da Biologia Molecoalre - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana DNA Z = Forma a ZIG- ZAG per alternanza di conformazioni syn ed anti di nucleotidi contigui NB nelle pirimidine legame è ANTI per interferenza sterica tra lo zucchero e l O carbonilico in posizione 2 36

37 Figura 2.20A StruQure alterna=ve del DNA. 37

38 Nella stessa molecola di DNA possono coesistere tra\ di DNA B e di DNA Z da Biologia Molecolare - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana 38

39 Strutture secondarie insolite del DNA DNA a tripla elica Tratto di DNA duplex di circa bp con un filamento di sole pirimidine altro di sole purine può accogliere nel solco maggiore una 3 catena polinucleotidica di sole pirimidine con polarità 5-3 Le TRE basi (2 pirimidine e 1 purina) si affacciano verso la struttura interna formando legami H NON canonici: LEGAMI di HOOGSTEEN da Biologia Molecolare - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana 39

40 legami di Hoogsteen Quartetti di G Tra 4 tratti di DNA (o RNA) che contengano 3 o più G consecutive da Biologia Molecolare - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana 40

41 ripetizioni invertite quando sono presenti due copie della stessa sequenza in orientamento opposto Ripetizioni adiacenti Sequenza palindromica Ripetizioni separate Struttura cruciforme da Biologia Molecolare - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana 41

42 Struttura a forcina da Biologia Molecolare - Amaldi et al. Casa Editrice Ambrosiana DNA B DNA curvo Coppie di basi adiacenti non perfettamente parallele portano a piccoli ripiegamanti B. Se perturbazioni casuali: struttura un pò irregolare ma dritta C. Se regolari, gli angoli si sommano e portano a curvatura DNA coppie di basi A:T adiacenti hanno una intrinseca tendenza a piegarsi dalla parte del solco minore, mentre 2 paia G:C hanno una tendenza inversa Se tratto di DNA contiene, più di 2 coppie A:T ripetute ogni giro di elica, 42

43 superavvolgimento del DNA Figura 2.42 La replicazione e la trascrizione del DNA generano superavvolgimen= della doppia elica. 43

44 DNA circolare costituito da 84 bp Rilassato contiene 8 giri di doppia elica (1 giro ogni 10,5 bp, 84/8) Rimozione di un giro porta a deformazione strutturale (1 giro ogni 12 bp, 84/7) La deformazione è riequilibrata: a. dal superavvolgimento b. oppure tramite la parziale separazione delle due catene a una distanza di circa 10 bp. NB La deformazione provocata dal disavvolgimento è generalmente risolta dal superavvolgimento piuttosto che dalla separazione delle catene l avvolgimento dell asse del DNA richiede meno energia della rottura dei legami idrogeno che tengono unite le due catene. 44

45 L k (Linking number) = numero di volte che la seconda catena ruota intorno alla prima NON varia quando la doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione L k = T w + W r T w = numero di twisting (torsione) o numero di giri di elica di Watson e Crick = n tot bp/ bp x giro d elica. W r = numero di writhing o numero di superavvolgimenti 260bp 25 giri (10,5 bp x giro) unendo estremità: molecola DNA rilassata srotolando DNA (di 2 giri) prima di unire estremità 23 giri di elica + 1 anello srotolato INTRODUZIONE DI UN SUPERAVVOLGIMENTO superavvolto: 25 giri di elica + 2 giri di superavvolgimento destrorso (superelica negativa) 45

46 La Topologia è lo Studio matematico delle proprietà di un oggetto che NON cambiano in seguito a deformazioni PROPRIETÀ TOPOLOGICHE DEL DNA - non è alterato dalla torsione e dal ripiegamento dell asse - Può essere modificato solo con rottura ed ricongiungimento della sua struttura Lk è una proprietà topologica del DNA NON varia quando la doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione Parziale disavvolgimento o iperavvolgimento di due giri di elica portano a superavvolgimento negativo o positivo ΔLk è negativo: introduzione di superavvolgimenti negativi e/o minor numero di avvitamenti dell elica ΔLk è positivo: introduzione di superavvolgimenti positivi e/o maggior numero di avvitamenti della doppia elica. TOPOISOMERI: Forme di DNA che differiscono solo per il numero di legame. stessa sequenza nucleotidica ma diverso grado di superavvolgimento 46

47 I topoisomeri di DNA si possono interconvertire soltanto tagliando uno o entrambi i filamenti del DNA e poi ricongiungendoli. Le topoisomerasi catalizzano questa reazione mediante un processo a tre tappe: 1) Taglio di uno o entrambi i filamenti di DNA 2) Passaggio di un segmento di DNA attraverso questa rottura 3) Chiusura della rottura sul DNA. 47

48 topoisomerasi di tipo I topoisomerasi di tipo I catalizza l aumento del numero di legame (L) di una unità (+1) ad ogni ciclo catalitico: esso favorisce pertanto il rilassamento del DNA superavvolto negativamente. - taglia solo un filamento del duplex - enzima rimane legato covalentemente all estremità 5 - estremità 3 è libera di ruotare e di attaccare nucleofilicamente il 5 fosfato attivato. 48

49 L enzima (due catene A di 105 kda e due catene B) catalizza l introduzione di superavvolgimenti negativi. è un trasduttore di energia: converte l energia libera dell ATP nell energia torsionale dei superavvolgimenti. 1) Avvolgimento di 200 bp attorno all enzima 2) Il legame dell ATP dà inizio al taglio di entrambi i filamenti. 3) Il terminale 5 - fosfato di ciascun filamento viene legato a un residuo di tirosina di ogni subunità A. 4) Un segmento di DNA a doppia elica passa quindi attraverso l interruzione formatasi tra le due estremità ancorate alle subunità A. topoisomerasi di tipo II (DNA girasi) Frazionamento di Topoisomeri mediante elettroforesi su gel di agarosio forma CIRCOLARE corre + lenta perché è la più ingombrante e fa più fatica a muoversi all interno dei pori del gel; forma SUPERAVVOLTA corre + veloce perché è + compatta; > giri superavvolgimento + topoisomerasi I (2, 4, 6, 8 unità) topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno maggiore writhe, per cui sono più compatti > Velocità migrazione DNA 49

50 Il DNA, carico ( ) a ph neutro, migra verso il polo positivo Colorante fluorescente (intercalante) 50