Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 19

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 19

2 Acidi nucleici Concetti chiave: Le basi azotate dei nucleotidi comprendono due tipi di purine e tre tipi di pirimidine. Il DNA contiene i deossiribonucleotidi adenina, guanina, citosina e timina, mentre l'rna contiene i ribonucleotidi adenina, guanina, citosina e uracile.

3 I nucleotidi I nucleotidi rappresentano la forma di energia corrente che viene utilizzata nelle attività metaboliche. I nucleotidi sono segnali chimici. I nucleotidi sono i componenti strutturali di un certo numero di cofattori enzimatici. I nucleotidi sono i costituenti degli acidi nucleici.

4 I nucleotidi I nucleotidi trasportano energia chimica

5 Gli zuccheri dei nucleotidi: ribosio e deossiribosio Nel deossiribosio il gruppo ossidrilico -OH nella posizione 2 (-OH) viene sostituito da un atomo di idrogeno.

6 Strutture chimiche di nucleotidi L atomo di carbonio anomerico è legato all atomo di azoto di un amina mediante un legame N- glicosidico. I legami N-glicosidici hanno una configurazione β in quasi tutte le biomolecole naturali.

7 Le basi dei nucleotidi sono derivati di purine e pirimidine Le basi presenti nei nucleotidi sono molecole planari, aromatiche ed eterocicliche che derivano dalla purina e dalla pirimidina.

8 Le basi dei nucleotidi sono derivati di purine e pirimidine Le basi presenti nei nucleotidi sono molecole planari, aromatiche ed eterocicliche che derivano dalla purina e dalla pirimidina. 6-amminopurina 2-ammino-6-idrossipurina (Pir) 4-ammino-2-idrossipir. 2,4-diossipir. 2,4-diosso-5-metilpir.

9 Conformazioni del ribosio

10 L anello ribofuranosico può esistere in quattro diverse conformazioni Quattro dei cinque atomi sono coplanari; il quinto (il C-2 o il C-3 ) può essere sullo stesso lato del piano in cui si trova l atomo C-5 (conformazione endo); oppure sul lato opposto (conformazione eso).

11 Le basi degli acidi nucleici, i nucleosidi e i nucleotidi

12 Ribonucleotidi

13 Deossiribonucleotidi

14 Basi minori del DNA Il DNA e l RNA possono contenere piccole quantità di altre basi meno comuni. Deossiribosio Deossiribosio Deossiribosio Deossiribosio

15 Basi minori dell RNA

16 Le cellule contengono anche nucleotidi con gruppi fosforici in posizioni diverse dalla 5 Adenosina 5 -monofosfato Adenosina 2 -monofosfato Adenosina 3 -monofosfato Adenosina 2,3 -monofosfato ciclico

17 Legami fosfodiesterei Estremità 5 Estremità 5 Negli acidi nucleici i nucleotidi sono uniti da legami fosfodiesterei a formare polimeri. I nucleotidi del DNA e dell RNA sono uniti tra loro in successione mediante ponti covalenti tra gruppi fosforici, in cui il gruppo ossidrilico 5 di un unità nucleotidica è unito al gruppo ossidrilico 3 di quella successiva, formando un legame fosfodiestere. Lo scheletro covalente degli acidi nucleici è costituito da un alternanza di gruppi fosforici e di residui di pentosio, mentre le basi azotate possono essere considerate come gruppi laterali uniti allo scheletro. Lo scheletro covalente del DNA e dell RNA è idrofilico. Estremità 3 Estremità 3

18 Idrolisi acidi nucleici Lo scheletro covalente del RNA, ma non quello del DNA, viene idrolizzato rapidamente in ambiente alcalino. Il gruppo ossidrilico in posizione 2 partecipa al processo idrolitico. L assenza del gruppo ossidrilico sull atomo di carbonio 2 nel DNA aumenta la sua resistenza all idrolisi.

19 Rappresentazione schematica di una sequenza nucleotidica

20 Basi azotate Le purine e le pirimidine sono composti moderatamente basici e per questo motivo vengono chiamate basi. Le pirimidine sono pertanto molecole planari e le purine presentano solo un leggero ripiegamento. Le basi puriniche e pirimidiniche libere possono esistere in due o più forme tautomeriche a seconda del ph della soluzione. Forme tautomeriche dll uracile la forma predominante a ph 7 è la forma chetonica o lattamica

21 Forme tautomeriche delle basi

22 Basi azotate Sempre per effetto della risonanza, tutte le basi assorbono la luce UV, e gli acidi nucleici sono caratterizzati proprio da un elevato assorbimento della luce a una lunghezza d onda intorno a 260 nm.

23 Basi azotate Le purine e le pirimidine sono molecole idrofobiche e relativamente poco solubili in acqua ad un ph neutro. Le interazioni di impilamento idrofobico, in cui i piani degli anelli di due o più basi si vengono a trovare in posizioni parallele, l una sopra all altra, rappresentano uno dei due principali sistemi di interazione tra le basi. I gruppi funzionali più importanti delle basi puriniche sono gli atomi di azoto degli anelli, i gruppi carbonilici e i gruppi amminici esociclici. Tali gruppi instaurano specifici legami idrogeno che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici.

24 Acidi nucleici Concetti chiave: Un elica di DNA può assumere le conformazioni A, B o Z. La libertà conformazionale del legame glicosidico, dell anello di ribosio e dello scheletro zucchero-fosfato è limitata. La struttura di un acido nucleico a doppio filamento è stabilizzata dai legami idrogeno che si formano tra le coppie di basi, dalle interazioni dovute all impilamento delle basi e dalle interazioni ioniche. Il DNA può essere denaturato per riscaldamento e rinaturato per riassociazione (annealing). L RNA assume forme più varie del DNA e, in alcuni casi, ha proprietà catalitiche.

25 Regole di Chargaff Erwin Chargaff, alla fine degli anni 40 sviluppò il primo metodo quantitativo valido per la determinazione della composizione del DNA. Sulla base di dati sperimentali ipotizzò che: La composizione in basi varia da una specie all altra Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi della stessa specie hanno la stessa composizione in basi La composizione in basi del DNA di una data specie non si modifica con l età dell organismo, con lo stato nutrizionale o in seguito a variazioni dell ambiente In tutte le molecole di DNA, indipendentemente dalla specie cui appartiene, la quantità di:

26 Immagine della diffrazione a raggi X del DNA Rosalind Franklin e Maurice Wilkins analizzarono all inizio degli anni 50 i cristalli di DNA con il metodo della diffrazione dei raggi X. Risultati: I polimeri di DNA erano elicoidali con due periodicità lungo il loro asse: una primaria di 3,4 Å e una secondaria di 34 Å.

27 Livelli strutturali degli acidi nucleici La struttura primaria di un acido nucleico è la sua struttura covalente Qualsiasi struttura stabile e regolare assunta da una parte o da tutti i nucleotidi di un acido nucleico può essere considerata come struttura secondaria Il complesso ripiegamento di un cromosoma all interno del nucleoide batterico o della cromatina degli eucarioti viene in genere considerato come struttura terziaria Fibra di cromatina da 30 nm PDBid 1ZBB

28 La doppia elica del DNA Nel 1953 James D. Watson e Francis Crick proposero un modello tridimensionale della struttura del DNA che poteva spiegare tutte le proprietà sino ad allora note. Nel 1962, James D. Watson e Francis Crick hanno ricevuto, per questa scoperta, il Premio Nobel per la Medicina

29 La doppia elica del DNA Il DNA ha una struttura costituita da due catene elicoidali avvolte intorno allo stesso asse per formare una doppia elica destrorsa. Lo scheletro covalente idrofilico, composto da un alternanza di deossiribosio e gruppi fosforici, è all esterno della doppia elica, in contatto con l ambiente circostante. Le basi puriniche e pirimidiniche sono impilate all interno della doppia elica con le loro strutture planari ad anello poste in posizione praticamente perpendicolare al lungo asse longitudinale della molecola. La relazione spaziale che si crea tra le catene genera una scanalatura maggiore (o solco maggiore) e una scanalatura minore (o solco minore) sulla superficie della doppia elica.

30 La doppia elica del DNA Ogni base nucleotidica di una catena è appaiata sullo stesso piano con una base dell altra catena mediante legami idrogeno (G C; A=T). Le due catene dell elica sono antiparallele. L anello furanosico di ogni residuo di deossiribosio è nella conformazione C-2 endo.

31 La doppia elica del DNA Il modello originale proponeva che vi fossero 10 coppie di basi oppure 34 Å per ogni giro dell elica.

32 La doppia elica del DNA Misure successive hanno dimostrato che in ogni giro d elica vi sono 10,5 coppie di basi e 36 Å.

33 La doppia elica del DNA La doppia elica del DNA viene tenuta insieme da due gruppi di forze: I legami idrogeno tra coppie di basi complementari Le interazioni idrofobiche tra le basi impilate

34 La doppia elica del DNA Le molecole degli acidi nucleici a doppia elica contengono due scanalature, dette solco maggiore e solco minore. Solco maggiore Solco minore A causa del fatto che i legami glicosidici non sono diametralmente opposti l uno all altro, ciascuna coppia di basi ha un lato più esteso che delimita la scanalatura maggiore e un lato meno esteso che delimita la scanalatura minore, caratterizzate da potenziali donatori e accettori di legami idrogeno.

35 La doppia elica del DNA Le Sono state descritte numerose deviazioni dalla struttura del DNA descritta da Watson e Crick (forma B del DNA). Le variazioni strutturali dipendono da tre fattori: Una conformazione diversa del deossiribosio. Rotazioni intorno ai legami contigui che fanno parte dello scheletro di fosfodeossiribosio.

36 La doppia elica del DNA Rotazione libera intorno al legame N-glicosidico sul C-1 A causa di costrizioni steriche, i nucleotidi purinici e pirimidinici possono assumere solo 2 conformazioni stabili rispetto al deossiribosio, dette sin e anti. Le pirimidine sono in genere nella conformazione anti a causa di interferenze steriche tra lo zucchero e l ossigeno carbonilico sul C-2.

37 La doppia elica del DNA La struttura proposta da Watson e Crick (forma B del DNA) è quella più stabile per una molecola di DNA con sequenza casuale e in condizioni fisiologiche.

38 DNA A La forma A è favorita in condizioni di disidratazione Il DNA è sempre organizzato in una doppia elica destrorsa L elica è un po più larga e più corta dell elica B Le coppie di basi sono maggiormente ruotate rispetto all asse dell elica in confronto a quelle della forma B, che sono quasi perpendicolari Il numero di coppie di basi per giro d elica è 11 invece di 10,5.

39 DNA A Molte delle differenze strutturali esistenti tra il DNA-B e il DNA-A derivano da una diversa compattazione delle loro unità di ribosio. Nel DNA-A l atomo di carbonio in posizione 3 si trova fuori dal piano della molecola formato dagli altri quattro atomi dell anello furanosico (conformazione endo-c-3 ). Nel DNA-B è invece il carbonio in posizione 2 a trovarsi fuori dal piano (conformazione endo-c-2 ). La maggiore vicinanza delle strutture endo-c-3 nel DNA-A determina una inclinazione di 19 delle coppie di basi. I gruppi fosforici e altri gruppi dell elica di tipo A legano meno molecole di acqua rispetto a quelli del DNA-B. La disidratazione quindi favorisce la forma A. La modificazione strutturale presente nel DNA A rende più profondo il solco maggiore e meno profondo il solco minore. Le regioni a doppia catena di RNA e alcuni ibridi RNA-DNA adottano una forma a doppia elica simile a quella del DNA-A.

40 DNA Z Il DNA-Z è una doppia elica sinistrorsa nella quale lo scheletro zucchero-fosfato è disposto a zigzag. La forma Z del DNA è radicalmente diversa dalla forma B. La differenza più evidente è la rotazione dell elica in senso sinistrorso. Vi sono 12 coppie di basi per giro d elica e la struttura appare più sottile ed allungata.

41 DNA Z Alcune sequenze nucleotidiche si ripiegano in eliche Z sinistrorse molto più facilmente di altre (es.: purine alternate a pirimidine). Sono necessarie concentrazioni elevate di sali per ridurre al minimo le repulsioni elettrostatiche tra i gruppi fosforici dello scheletro, che nella struttura Z sono più vicini gli uni agli altri. I residui di purina devono saltare alla conformazione sin, alternandosi a residui di pirimidina nella conformazione anti. Il solco maggiore è appena accennato e il solco minore è stretto e profondo.

42 Strutture del DNA-A, -B e -Z

44 Strutture del DNA-A, -B e -Z DNA A DNA B DNA Z

46 Sequenze palindromiche Alcune sequenze di DNA adottano strutture insolite. Un palindromo è una parola che risulta la stessa letta in una direzione o in quella inversa (es.: OSSESSO). Il termine viene applicato alle regioni di DNA di in cui vi sono ripetuti invertiti di una sequenza di basi con una doppia simmetria presente nelle due catene del DNA. Quando la sequenza è presente in ciascuna catena, la sequenza viene detta ripetuto speculare.

47 Sequenze palindromiche Un palindromo può formare strutture a forcina e a forma di croce

48 DNA H Un organizzazione insolita del DNA, nota con il nome di DNA H, si può formare in tratti di polipirimidine/polipurine che contengono anche all interno della sequenza ripetuti speculari. Questa struttura produce un brusco ripiegamento del DNA.

49 mrna

50 Struttura RNA Per l RNA non esiste una semplice struttura secondaria che rappresenti un punto di riferimento per la sua struttura, come accade per la doppia elica del DNA Le interazioni deboli, in particolare le interazioni idrofobiche tra le basi impilate, sono determinanti per la stabilità della struttura. Quando sono presenti sequenze complementari, la struttura predominante è una doppia elica destrorsa nella forma A dettata dalle interazioni create dall impilamento delle basi

51 Struttura RNA Possibile struttura secondaria dell RNA M1, un componente dell enzima RNasi P1 di E. coli. L RNA si può appaiare a catene complementari di DNA o di RNA. Le regole sono le stesse del DNA: La G si appaia con la C. La A con la U (o con la T, occasionalmente presente nell RNA). Un eccezione è l appaiamento della G con la U, facilmente riscontrabile tra due catene di RNA ma assente nel DNA. Le catene appaiate di RNA o di RNA-DNA duplex sono antiparallele, come nel DNA.

52 Struttura secondaria degli RNA

53 Struttura 3D del trna della fenilalanina di lievito

54 Il ribozima a testa di martello Ribozima a testa di martello PDBid 2GOZ

55 Metodo di sequenziamento del DNA mediante scissione chimica (Maxam & Gilbert) DNA a doppia elica Marcato con isotopo radioattivo Le due catene si separano DNA a singola elica La preparazione a singola elica viene trattata con reagenti chimici che demoliscono selettivamente specifiche basi G A+G T+C C Dimetilsolfato (c.alcaline) Dimetilsolfato (c.acide) Idrazina (piperidina) Idrazina (2M NaCl) I frammenti si separano mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. La rivelazione dei frammenti marcati con radioattivo viene effettuata mediante autoradiografia

56 Frammenti più lunghi Migrazione elettroforetica G A+G T+C C Sequenza Frammenti più corti Le bande sulla lastra corrispondono ai frammenti tagliati in corrispondenza di ogni base demolita T G A C G C T G A T T A G T C G C A G T A T C A G C G T C A Sequenza dell elica analizzata Sequenza dell elica complementare

57 Metodo di sequenziamento del DNA a terminazione di catena (Sanger) DNA stampo Inneschi marcati Miscela di reazione Terminatori di catena ddatp ddgtp ddctp ddttp Cicli di sequenziamento Gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti

58 Didesossinucleotide Non si può formare un legame fosfodiestere con il gruppo fosfato in 5 dei dntps I didesossinucleotidi sono terminatori di catena

59 Didesossinucleotide

60 Metodo di sequenziamento del DNA a terminazione di catena (Sanger) 5 Catena di DNA stampo 3 T T C G A C A C G A T A A T A T T DNA polimerasi+ 4 dntp+ ddgtp Primer marcato 5 3 T T C G A C A C G A T A A H H H H H H G C T A T T + G T G C T A T T + G C T G T G C T A T T

61 Frammenti più lunghi Migrazione elettroforetica Frammenti più corti ddatp ddttp ddctp ddgtp Sequenza T G A C G C T G A T Sequenza di DNA della catena originale

62 Metodo di sequenziamento del DNA a terminazione di catena (Sanger)

63 Sequenziatore automatico di acidi nucleici bp all anno (metodo manuale) bp al giorno (metodi automatizzati)

64 Denaturazione degli acidi nucleici Il calore e ph estremi, così come determinano la denaturazione delle proteine globulari, causano anche la denaturazione (o fusione) del DNA a doppia elica. Il processo avviene mediante la rottura dei legami idrogeno tra le basi appaiate e delle interazioni idrofobiche tra le basi impilate. La doppia elica si apre liberando le due catene singole. I legami covalenti del DNA non vengono rotti. Quando la temperatura o il ph vengono riportati a valori vicini a quelli fisiologici, i segmenti srotolati delle due catene si riavvolgono (riassociazione o annealing)

65 Denaturazione degli acidi nucleici Ogni specie di DNA ha una temperatura di denaturazione caratteristica, detta anche punto di fusione (tm).

66 Relazione tra il tm e il contenuto di GC di un DNA Il punto di fusione è tanto più alto quanto più alto è il contenuto in coppie di basi GC

67 Effetto ipercromico L interazione tra le basi impilate ha l effetto di ridurre la quantità di luce UV assorbita e, pertanto, un filamento singolo di DNA assorbe la luce in maniera più efficace rispetto ad una molecola di DNA a doppio filamento. L assorbimento della luce a 260 nm di una soluzione di DNA aumenta quando la doppia elica fonde e le catene si separano. La transizione da DNA a doppia elica a DNA denaturato a catena singola può essere monitorata misurando l assorbimento della luce UV.

68 Relazione tra il tm e il contenuto di GC di un DNA E possibile visualizzare il DNA parzialmente denaturato

69 Duplex idridi Gli acidi nucleici di specie diverse possono formare ibridi

70 Duplex ibridi Possono essere denaturati anche gli acidi nucleici a doppia catena composti da due catene di RNA o da una catena di RNA e una di DNA. I duplex di RNA sono molto più stabili di quelli di DNA. A ph neutro, un RNA a doppia elica spesso si denatura a una temperatura almeno 20 C più alta di quella richiesta da una molecola di DNA con una sequenza comparabile. La stabilità dell ibrido RNA-DNA è in genere intermedia tra quella dell RNA e quella del DNA. La capacità di appaiamento di due catene di DNA (o di RNA o di DNA-RNA) complementari può essere utilizzata per identificare sequenze di DNA simili in specie diverse oppure nel genoma della stessa specie. Elica ibrida RNA-DNA di 10-bp PDBid 1FIX

71 La doppia elica del DNA La struttura del DNA suggerisce che ogni catena può agire da stampo per la sintesi della catena complementare e che le informazioni ereditabili siano codificate nella sequenza di basi su ogni singola catena.

72 Replicazione del DNA Il DNA porta con sé l'informazione genetica sotto forma della propria sequenza di nucleotidi. La sequenza dei nucleotidi del DNA viene trascritta nella sequenza dei nucleotidi dell'rna messaggero che è poi, a sua volta, tradotta in una proteina, cioè in una sequenza di amminoacidi. Dogma centrale della biologia

73 La trascrizione e la traduzione