Tuttavia, a causa di guasti o malfunzionamenti dell impianto si è dovuto, talvolta, rinunciare o posticipare il campionamento.

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1 Tuttavia, a causa di guasti o malfunzionamenti dell impianto si è dovuto, talvolta, rinunciare o posticipare il campionamento. Figura 4.8 Cronoprogramma dei campionamenti 42

2 4.5 Parametri indagati Parametri chimico-fisici I parametri chimico-fisici misurati per la sperimentazione sono stati: Temperatura dell acqua ( C), è uno dei più importanti fattori fisici che influenza la crescita e la selezione delle specie. Infatti, con l aumento di temperatura diminuisce l ossigeno disciolto in acqua e aumenta la velocità delle reazioni chimiche e biochimiche che possono comportare, tra l altro, una proliferazione algale con ulteriore consumo di ossigeno e sviluppo di idrogeno solforato e metano e quindi cattivi odori. Normalmente la crescita microbiologica avviene in un intervallo che va dai -12 C ai 120 C, con una crescita ottimale tra i 30 C e i 40 C. Concentrazione idrogenionica (ph), come la temperatura, influenza la vita e lo sviluppo microbiologico. La maggior parte dei microrganismi può vivere in un intervallo di valori che va da 5 a 9 di ph con condizioni ottimali intorno a ph 7. I refluo in ingresso normalmente ha un ph di 7,3-7,4. Conducibilità elettrica (µs/cm), l acqua pura è un cattivo conduttore di elettricità, sono, infatti, agenti esterni come i sali disciolti, che rendono l acqua capace di condurre elettricità. Per questo la conducibilità elettrica risulta essere un buon indicatore del grado di impurità di un acqua. Per la maggior parte degli usi agricoli e urbani la conducibilità elettrica dovrebbe stare al di sotto dei 1500µS/cm µS/cm. Per gli usi domestici sotto i 750µS/cm, mentre per le acque potabili il valore guida è fissato sui 400µS/cm. Potenziale di ossido riduzione (mv), è un indicatore dell'indirizzo che assumono alcuni processi chimici o biochimici 43

3 di trasformazione, ogni specie chimica, infatti, si trova in uno specifico stato di ossidazione e in presenza di un agente ossidante,o riducente, può ossidarsi, o ridursi in virtù della differenza di potenziale standard di riduzione. Tali misurazioni sono state realizzate in tempo reale con uno strumento portatile wtw156 multiparametrico da campo dotato delle specifiche sonde, al momento dei prelievi. I dati di piovosità e temperatura atmosferica sono stati gentilmente forniti del Servizio Centro Meteorologico Teolo (PD) di ARPAV Parametri chimici Le analisi dei parametri chimici sono state compiute dal laboratorio chimicobiologico di Etra s.p.a. ed hanno riguardato: Azoto ammoniacale N-NH4 (mg/l), si forma per ossidazione della materia organica ed è un indicatore sia d inquinamento agricolo, sia d inquinamento urbano. Può indicare intensi fenomeni di degradazione batterica in ambiente anaerobico. Nelle acque superficiali rappresenta un nutriente per il fitoplancton, se in eccesso, può per questo portare a fenomeni di eutrofizzazione. Azoto nitroso N-NO2 (mg/l), l azoto in questa forma rappresenta un composto intermedio nel processo di ossidazione dei composti organici dell azoto e dell ammoniaca a nitrato. La sua presenza indica, infatti, l esistenza di reazioni di ossidazione di composti ridotti dell azoto (azoto ammoniacale e azoto organico). Nelle acque superficiali rappresenta normalmente una piccola frazione dell azoto totale. In condizioni aerobiche l azoto nitroso di solito viene rapidamente ossidato in azoto nitrico 44

4 mentre in condizioni anaerobiche viene inizialmente ridotto a ossido di azoto (N2O) per poi essere ulteriormente ridotto ad azoto gassoso (N2). Azoto nitrico N-NO3 (mg/l), rappresenta lo stato più ossidato dell azoto e in ambienti ossigenati è molto stabile, mentre in ambienti anaerobici ed in presenza di particolari specie batteriche può essere ridotto ad azoto gassoso attraverso il processo di denitrificazione. Nelle acque superficiali può essere assunto come nutriente da svariate forme vegetali e provocare eutrofizzazione, e se, in elevate concentrazioni, risultare tossico per gli ecosistemi e per l uomo.generalmente arriva nelle acque superficiali soprattutto attraverso il dilavamento delle superfici agricole fertilizzate e attraverso il runoff urbano. Azoto totale disciolto (mg/l), rappresenta la quantità totale di azoto, sia in forma organica sia in forma ossidata, sia in forma ammoniacale. Azoto organico disciolto (mg/l), si calcola sottraendo il valore di azoto nitroso, nitrico e ammoniacale dal valore dell azoto totale. Il valore risultante rappresenta una grande porzione di azoto organico fissato presente in forme difficilmente individuabili con le tradizionali analisi chimiche (ad es. acido urico, aminoacidi, etc). Azoto ossidato (mg/l), è calcolato sommando l azoto nitrico e l azoto nitroso, le due forme ossidate di azoto misurate nel presente studio. Fosforo (mg/l), il fosforo non si trova in natura allo stato elementare, tuttavia, sotto forma di fosfato è abbondante in alcune rocce e nelle cellule degli esseri viventi. La presenza di fosfati in un refluo è dovuta al loro utilizzo in agricoltura, come fertilizzante. Nelle acque superficiali, pertanto, può provocare fenomeni di eutrofizzazione. COD (mg/l di O2), misura la quantità di ossigeno utilizzata per l ossidazione di sostanze organiche e inorganiche 45

5 contenute in acqua. Un refluo che presenta un alto valore di COD, necessita di una alta concentrazione di O2 disciolto per l ossidazione delle sostanze in esso contenute Parametri microbiologici Le determinazioni microbiologiche sono state eseguite nel Laboratorio di Microbiologia Ambientale del Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica Igiene seguendo le linee guida indicate nel manuale 29/2003 IRSA-CNR. Si sono focalizzate su alcuni di quei gruppi di microrganismi che caratterizzano i reflui urbani non depurati, comunemente utilizzati per la determinazione della qualità delle acque, la cui presenza può essere dannosa per l uomo e le biocenosi e dare, di conseguenza, una misura del funzionamento dei sistemi di depurazione oggetto di questa tesi. I parametri microbiologici presi in esame sono stati: Coliformi totali (UFC/100ml), appartengono alla famiglia delle enterobatteriacee, sono aerobi ed anaerobi facoltativi. Con il termine coliformi totali si intendono più di un genere, tra cui Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Si trovano in elevate concentrazioni nel materiale fecale di origine umana anche se alcuni membri di questo gruppo sono largamente diffusi naturalmente anche nell ambiente, dove colonizzano suolo, acqua, aria e vegetazione (Brianesco et alii, 2005). Coliformi fecali (UFC/100ml), sono un sottogruppo dei coliformi totali più strettamente correlati al tratto intestinale degli animali a sangue caldo in genere. Negli ultimi anni sono emerse alcune perplessità sul loro utilizzo come indicatori di contaminazione fecale e per questo si è adottato Escherichia coli come parametro indicatore più specifico. 46

6 Escherichia coli (UFC/100ml), è una specie tassonomicamente definita del gruppo dei coliformi fecali, ha una maggiore stabilità nelle acque ambientali durante tutto l anno rispetto ai coliformi totali e fecali e una maggiore resistenza ai principali sistemi di disinfezione. Inoltre è presente in elevate concentrazioni nelle feci umane, fino 10 9 UFC/g. E l indicatore primario di contaminazione fecale tra i parametri da ricercare sia per la classificazione dei corsi d acqua superficiali, sia per il controllo delle emissioni degli scarichi idrici (Brianesco, 2005). Streptococchi totali (UFC/100ml), sono un genere di batteri anaerobi facoltativi, molte specie fanno comunemente parte della flora batterica dell uomo. Streptococchi fecali (UFC/100ml), gli streptococchi fecali sono un gruppo eterogeneo di microrganismi, comprendente specie tassonomicamente distinte associate al tratto gastrointestinale dell uomo e degli animali a sangue caldo. Nel gruppo sono incluse specie appartenenti a due diversi generi: Streptococcus ed Enterococcus. Rappresentano un utile indicatore d inquinamento fecale; oltretutto è stata riscontrata una stretta relazione tra presenza di streptococchi fecali e rischio di gastroenteriti in acque marine e superficiali balneabili. Diversamente dai coliformi, gli streptococchi fecali non sono ubiquitari, ma sono sempre presenti nelle feci degli animali a sangue caldo e non si moltiplicano nelle acque contaminate da reflui. Clostridi solfito riduttori (UFC/100ml), al genere Clostridium appartengono bacilli anaerobi obbligati, sporigeni, che riducono il solfito con produzione di solfuro. La maggior parte dei clostridi sono saprofiti, vivono negli strati superficiali poveri di ossigeno del suolo e dei sedimenti e nell intestino di alcuni animali a sangue caldo. Alcune specie sono fortemente patogene per l uomo (Clostridium tetani e Clostridium botulinum) a causa delle loro potenti tossine. Poiché le spore dei clostridi solfito- 47

7 riduttori sopravvivono per lunghi periodi nell acqua e sono più resistenti dei coliformi e degli streptococchi ai trattamenti di disinfezione, possono essere utilizzate, insieme ai classici indicatori, come indicatori secondari di efficienza di trattamenti delle acque. Conta microbica totale a 37 C e 20 C (UFC/ml), questo tipo di analisi ha la caratteristica di poter valutare la qualità microbiologica dell acqua. Il metodo rileva la presenza in termini non specifici, di batteri, spore batteriche, microrganismi di origine fecale, e di ospiti naturali degli ambienti acquatici, che possono alterare i caratteri organolettici dell acqua o dar luogo a infezioni opportunistiche. Il conteggio delle colonie batteriche è uno dei più affidabili e sensibili indicatori dell inefficacia della disinfezione, della proliferazione di batteri nei sistemi di distribuzione e della formazione di biofilm. Un cospicuo numero di colonie batteriche a 37 C può rappresentare un segnale d inquinamento, da verificare poi con gli altri parametri microbiologici. Legionella spp. (presenza/assenza), Nel genere Legionella sono presenti numerose specie, alcune delle quali, come L. pneumophila potenzialmente molto pericolose per l uomo. Legionella sp. è un batterio aerobio, ubiquitario, è presente infatti, nelle sorgenti, comprese quelle termali, nei fiumi, laghi, vapori, terreni. Da questi ambienti possono risalire in condotte cittadine, negli impianti idrici degli edifici, quali serbatoi, tubature, fontane e piscine. Sebbene i siti di proliferazione ottimale di Legionella, siano altri, come ad esempio impianti di condizionamento, o là dove ci sia stagnazione di acqua a temperature comprese tra i 15 C e i 50 C, potrebbero verificarsi situazioni tali da permettere la sua sopravvivenza anche nei sistemi oggetto di questo studio. Le tecniche analitiche utilizzate, ad esclusione di quella per la conta microbica totale, utilizzano le membrane filtranti. Questa tecnica, 48

8 permette di rilevare, per conta diretta, il numero di microrganismi presenti nel campione esaminato, contando le colonie sviluppatesi su una membrana, posta su un terreno di coltura agarizzato idoneo e specifico per la loro crescita. Normalmente il numero di colonie ottenuto si riporta come Unità Formante Colonia (UFC) per 100 ml di liquido filtrato. Per avere un elevata accuratezza del dato è però necessario che il numero delle colonie sia compreso in limiti leggibili. Un numero di colonie della membrana compreso generalmente tra 20 UFC e 200 UFC fornisce un risultato accettabile e statisticamente accurato (IRSA-CNR, 2003). Normalmente la procedura consiste nel filtrare, in condizione di asepsi, aliquote predefinite di campione con membrane di esteri di cellulosa con porosità nominale 0,45 µm (0,20 µm per la legionella) montate su apposite rampe di filtrazione in acciaio (Fig. 4.9) a loro volta collegate ad una pompa a vuoto per l aspirazione del campione. Figura 4.9 Rampe di filtrazione I terreni di coltura utilizzati sono stati acquistati in forma di polveri e poi preparati secondo le indicazioni riportate dalle case produttrici, in condizioni di asepsi e utilizzando piastre Petri monouso e provette in vetro sterilizzate con calore secco. Per la crescita dei batteri, i substrati di crescita sono stati posti in camera termostatata secondo i tempi e le modalità previste da ciascun protocollo. 49

9 4.6 La DEC (Decimal Elimination Capacity) La capacità di eliminazione di un processo è espressa in percentuale di eliminazione o, utilizzando il logaritmo del rapporto tra la concentrazione media in entrata e in uscita del sistema (Groennou et alii, 1999). Pertanto per l espressione dei dati e dell efficienza depurativa si è utilizzato, oltre al valore di concentrazione per parametro, in ingresso e in uscita, e quindi prima e dopo il trattamento, anche la Dec, una misura derivata secondo la seguente equazione: DEC logc in logc out C log C La Decimal Elimination Capacity (DEC) è stata utilizzata in questo studio insieme a quella percentuale, per valutare l efficienza di abbattimento microbiologico dei diversi sistemi presi in esame. in out 4.7 Metodi statistici Per l elaborazione dei dati è stato utilizzato il programma di statistica SPSS, versione 13.0 per Windows Xp. Non avendo una cospicua numerosità si sono utilizzati test non parametrici per l analisi statistica (test H di Kruskal-Wallis e il test U di Mann-Witney). I dati sono stati presentati prevalentemente con grafici di tipo boxplot. Per esaminare la stagionalità i 12 campionamenti disponibili sono stati raggruppati in 3 insiemi, con 4 campionamenti ciascuno relativi alle 3 stagioni coperte da questo studio: inverno, primavera, estate. I valori di ogni parametro microbiologico, fisico-chimico e chimico di ingresso (ING), uscita vasca piantumata (OUTA), uscita vasca non piantumata (OUTB) e uscita filtri a sabbia e UV (OUTC) sono stati comparati tra loro e tra loro per stagione con il test H di Kruskal-Wallis per i confronti tra le mediane di più di due campioni, per evidenziarne eventuali differenze significative. I parametri risultati 50

10 significativamente diversi sono stati poi comparati sempre per gruppo e per gruppo considerando la stagione con il test U di Mann-Whitney per il confronto delle mediane tra due gruppi. La significatività dei risultati non è stata corretta per la bassa numerosità dei dati per parametro. I risultati sono stati considerati significativi con P<0,05. 51