Introduzione e scopo del lavoro

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1 Introduzione e scopo del lavoro Con l avvento della rivoluzione industriale la nostra vita ha avuto un incremento qualitativo notevole; di pari passo l ambiente è stato sempre più sottoposto a stress dovuti ad un abuso incontrollato delle risorse naturali. In particolar modo gli ecosistemi acquatici sono interessati da un diffuso inquinamento, che ne altera in modo significativo la composizione cenobiotica riducendo drasticamente la biodiversità. Lo studio delle tecnologie depurative per i reflui destinati a confluire nella rete idrografica e nei bacini idrogeologici appare quindi prioritario. Lo studio oggetto di questa tesi rientra in un ampio programma sperimentale, atto a indagare le potenzialità di una recente tecnologia per il trattamento depurativo delle acque reflue, detta bioflottazione. La grande efficacia sinora dimostrata da questo processo nei confronti delle sostanze ad elevato tenore di carbonio (per intenderci, quelle che incrementano il parametro analitico espresso come COD), deve essere confermata anche per quelle azotate. Le moderne tecniche depurative tendono a trattare gli agenti inquinanti nel loro complesso, considerando nella tecnologia di processo sia quelli contenenti le diverse forme di azoto sia quelli a base di fosforo oltre al substrato di carbonio. Nel dettaglio la finalità di questo lavoro è stata lo studio delle rese di ossidazione biologica delle sostanze azotate in questo nuovo processo, considerando il reattore dell impianto pilota come un ecosistema artificiale controllato e gestito, in cui si instaura una comunità di batteri nitrificanti che permettono un accelerazione dei naturali processi depurativi, che altrimenti avverrebbero comunque nell ambiente acquatico con conseguenze estremamente dannose. 3

2 Generalità Ciclo dell azoto L azoto è uno degli elementi essenziali che costituiscono il protoplasma e, come tutti gli elementi essenziali, circola nella biosfera dall ambiente agli organismi e viceversa seguendo un percorso più o meno circolare detto ciclo biogeochimico dell azoto, un ciclo molto complesso diviso in due pools : Pool di riserva, che costituisce il componente più ampio, meno attivo e generalmente non biologico, che nel caso dell azoto è costituito dall atmosfera. Pool di scambio, la parte più attiva ed in rapido movimento tra gli organismi e l ambiente. L atmosfera, costituita per l 80% di azoto, è la riserva di questo sistema; infatti l azoto passa nell atmosfera ad opera dei batteri denitrificanti e da questa torna nel ciclo per azione di alghe e batteri azotofissatori (biofissazione), oltre che ad opera di fulmini e altri meccanismi fisici di fissazione. Inoltre va considerata l azione antropica che, con la fissazione industriale per la produzione di concimi e con la coltivazione delle leguminose, contribuisce in modo notevole al ritorno dell azoto in circolo. Parte dell azoto è perso dalle zone terrestri e finisce verso i sedimenti oceanici profondi, uscendo così dal ciclo per alcuni milioni di anni, mentre è rimpiazzato da quello che, contenuto nei gas vulcanici, si diffonde nell atmosfera ad ogni eruzione. 4

3 Il ciclo dell azoto è regolato da meccanismi a retroazione (feed-back) che lo mantengono in perfetto equilibrio. Fig. 1: ciclo dell azoto (tratta da: Basi di Ecologia Odum E. P.) 5

4 Biofissazione dell azoto atmosferico L energia necessaria per questo processo è tratta dalla sostanza organica o dall energia solare. Gli organismi capaci di fissare l azoto atmosferico si dividono in: Batteri liberi Azotobacter (aerobico) e Clostridium (anaerobico). Batteri simbionti su leguminose Rhizobium Alghe azzurre (cianobatteri) Anabena in simbiosi con la felce acquatica Azolla, Nostoc e altri membri dell ordine delle Nostocales. Batteri fotosintetici Rhodospirillum Batteri del terreno Pseudomonas Attinomiceti, funghi primitivi presenti nei noduli radicali delle seguenti famiglie: Alnus, Ceanothus, Comptonia, Elaeagnus, Myrica, Casuarina, Coriaria, Araucaria e Ginkgo. La biofissazione è mediata da un enzima, la nitrogenasi, che catalizza la scissione delle molecole di N 2, abbassando l energia di attivazione necessaria per la rottura del triplo legame NΞN, in modo da convertirla (con somma di idrogeno dall acqua) in due molecole di ammoniaca. La nitrogenasi è costituita da due componenti proteiche: componente I (P.M.= , 4 subunità, contenenti 24 atomi di Fe e 2 atomi di Mo) e componente II (P.M.= , 2 subunità con 2 atomi di Fe). Una proteina trasportatrice trasferisce gli elettroni alla nitrogenasi, che li fa reagire con N 2 attraverso il componente II e poi I, dove avviene la riduzione. Entrambi i componenti proteici si alterano irreversibilmente per contatto con l'o 2 atmosferico. Pertanto i microorganismi azotofissatori hanno sviluppato diversi accorgimenti per proteggere dall'o 2 i propri enzimi: ad esempio molti cianobatteri possiedono cellule specializzate (eterocisti) a 6

5 pareti ispessite, che contengono la nitrogenasi e la isolano dal contatto con l'o 2 atmosferico, oppure molti microrganismi azotofissatori anaerobi vivono solo in strati profondi del terreno, dove l'o 2 è assente. Il sistema più perfezionato di protezione contro l'o 2 atmosferico è comunque rappresentato dalla simbiosi tra Rhizobium e leguminose: l'o 2 non può raggiungere i batteri in quanto è legato da una proteina (leg-hb) sintetizzata dalla pianta nei noduli radicali e che lo cede solo quando necessario. Si è osservato che la biofissazione nei noduli radicali è dieci volte più efficiente della biofissazione negli organismi a vita libera. La simbiosi con le piante superiori è vantaggiosa sia per i microrganismi (habitat congeniale, protezione della nitrogenasi da un eccesso di O 2 che inibisce la fissazione, energia di alta qualità), sia per le piante che ottengono azoto immediatamente assimilabile. L'azoto viene poi reso disponibile in seguito al rilascio da parte delle popolazioni microbiche azotofissanti, oppure per cattura e digestione degli azotofissatori da parte di predatori. In questo modo l'azoto diventa disponibile per gli altri organismi che vivono in quello stesso ecosistema. 7

6 Mineralizzazione L azoto protoplasmatico, alla morte dell organismo, passa da una forma organica ad una inorganica (ammoniaca e nitrati) a causa dell azione mineralizzante di una serie di batteri decompositori, ciascuno specializzato per un particolare passaggio. Come tutti i viventi i Batteri hanno bisogno, per vivere e riprodursi, di energia e di una serie di elementi che, opportunamente elaborati, andranno a costituire i nuovi individui. La principale forma di energia sfruttata dai Batteri utilizzati per i processi di biodepurazione è quella contenuta nel legame chimico dei composti, da cui il nome di chemotrofi, a differenza dei fototrofi che utilizzano l energia luminosa. Un ulteriore suddivisione riguarda i Batteri chemotrofi in: Chemorganotrofi: utilizzano l energia chimica dei composti organici Chemolitotrofi: utilizzano l energia chimica dei composti inorganici Tra questi ultimi rientrano in particolare quelli trattati in questo lavoro, cioè i Batteri nitrificanti, che ricavano energia dall ossidazione dall ammoniaca a nitrito (appartenenti ai generi Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosobulos) e da nitrito a nitrato (generi Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus), mentre limitano le altre esigenze metaboliche a sostanze semplici come acqua, anidride carbonica, solfati e alcuni sali minerali (Foch e Verstraete, 1977). 8

7 Rimozione biologica dell azoto dalle acque reflue Le specie più interessanti nel campo dei trattamenti biologici sono sicuramente Nitrosomonas europea (sinonimo Nitrosomonas monocella) suddivisa in 13 ceppi* e Nitrobacter winogradskyi (sinonimo Nitrobacter agilis) a sua volta divisa in 6 ceppi. In letteratura è nota (Ramadori R., Tandoi V.) anche una nitrificazione eterotrofa, cioè realizzata da microrganismi che necessitano di carbonio organico per la crescita (Arthrobacter, Pseudomonas aeruginosa, Hansenula mrakii, Aspergillus flavus), che però avviene con una cinetica di due, tre ordini di grandezza inferiore a quella chemolitotrofa. Il processo di nitrificazione, trascurando la produzione di biomassa (0.15 mg di cellule per mg di azoto ammoniacale ossidato ad azoto nitrico), può essere rappresentato mediante le seguenti reazioni: Nitrosomonas sp. N-NH /2 O 2 N-NO H + + H 2 O Nitrobacter sp. N-NO ½ O 2 N-NO 3 Riassumendo: N-NH O 2 N-NO H + + H 2 O * il ceppo si individua tenendo conto del diverso comportamento fisiologico dei batteri nell ambito della stessa specie. 9

8 I batteri chemolitotrofi utilizzano l ammoniaca ed il carbonio inorganico per la sintesi cellulare, ottenendo l energia per il metabolismo dall ossidazione dell azoto ammoniacale a nitriti e nitrati e servendosi dell ossigeno molecolare come accettore finale di elettroni. Caratteristiche Genere Nitrosomonas sp. Nitrobacter sp. Forma ovoidale o bastoncello Dimensioni 0,6-0,8*1-2 µm 0,6-0,8*1-0,2 µm Motilità presente o meno Colorazione di negativa Gram Tempo di generazione 8-36 h h Autotrofia obbligata per entrambi Utilizzo anaerobiosi stretta per entrambi ossigeno Fig. 2: caratteristiche morfologiche e fisiologiche dei generi Nitrosomonas e Nitrobacter Assumendo che la composizione cellulare dei Nitrosomonas sp. e dei Nitrobacter sp. sia C 5 H 7 O 2 N e che i rendimenti di crescita per queste due specie batteriche siano rispettivamente 0.15 mg VSS*/mg N-NH 3 e 0.02 mg VSS*/mg N-NO 2, l equazione biochimica di ossidazione completa a nitrato è: N-NH O HCO C 5 H 7 O 2 N NO H 2 CO H 2 O * solidi sospesi volatili: esprimono la quantità di biomassa prodotta 10

9 Questa equazione evidenzia tre aspetti di notevole importanza nel processo: 1. La significativa richiesta di ossigeno: ne sono necessari circa 4,3 mg per mg di azoto ammoniacale ossidato ad azoto nitrico. Quindi è necessario assicurare almeno 2 mg/l di O 2 disciolto nelle vasche di reazione, perché sperimentalmente si è verificato che già sotto 1 mg/l la nitrificazione rallenta, sino a inibirsi completamente sotto il valore di 0.2 mg/l di O 2. Al contrario i batteri nitrificanti non sembrano soffrire eccessive concentrazioni di O 2 disciolto, almeno sino a valori di 60 mg/l. 2. La significativa richiesta di alcalinità necessaria a tamponare l acidità prodotta dal metabolismo batterico come acido carbonico (circa 7 mg come CaCO 3 per mg di azoto ammoniacale ossidato). Visti alcuni recenti studi (Ekama e Marais, 1984) si assume che i batteri nitrificanti crescano alla loro velocità massima nell intervallo di ph compreso tra 7.2 e 8.5. Appare quindi necessario prevedere la possibilità di dosaggio di un alcale, anche perchè il ph controlla la concentrazione di ammoniaca libera e l acido nitroso indissociato, sostanze inibenti l attività stessa dei batteri (Anthonisen et al., 1976). 3. La scarsa produzione di biomassa nitrificante per peso unitario di azoto ammoniacale ossidato; i rapporti stechiometrici indicano la produzione di solo 0.17 grammi di biomassa per ogni grammo di azoto ammoniacale ossidato. Altri importanti aspetti da sottolineare riguardo al processo di nitrificazione: I batteri nitrificanti sono sensibili all azione inibente di un gran numero di sostanze che agiscono sia interferendo nel metabolismo generale delle cellule sia bloccando la formazione dei vari composti 11