Controllo della crescita microbica

Transcript

1 Controllo della crescita microbica

2 I microrganismi sono praticamente ubiquitari. In un laboratorio possono contaminare: - aria - superfici e strumenti - operatori Sia che si lavori con colture pure, sia che si lavori con materiale contaminato da associazioni più o meno complesse di microrganismi è necessario evitare che il materiale sperimentale sia contaminato dai microrganismi presenti nell ambiente.

3 Per evitare la contaminazione è necessario: prevenire per quanto possibile la contaminazione con microrganismi presenti nell aria, o sulle superfici del laboratorio o sul corpo dell operatore utilizzare substrati sterili utilizzare attrezzi sterili

4 In microbiologia è molto importante tenere sotto controllo la Crescita microbica Tale sorveglianza può avvenire attraverso un processo di inibizione Oppure attraverso un processo di distruzione dei microrganismi detto sterilizzazione

5 Metodi fisici per il controllo della crescita microbica 1. Calore 2. Radiazioni 2. filtrazione

6 Scopo dell esercitazione Descrivere le principali attrezzature e strumenti presenti in un laboratorio di microbiologia: le precauzioni di asepsi strumenti e tecniche per la sterilizzazione

7 STERILIZZAZIONE Per sterilizzazione si intende quella procedura che permette di liberare un oggetto da tutte le forme viventi che vivono sulla sua superficie o al suo interno. Il termine ha un valore assoluto, nel senso che non esistono sostanze o oggetti poco o quasi sterili, ma solo sterili o non sterili.

8 TECNICHE DI STERILIZZAZIONE La sterilizzazione può essere ottenuta: con metodi fisici calore secco umido radiazioni UV raggi gamma filtrazione con metodi chimici ossido di etilene La scelta del metodo di sterilizzazione dipende dal materiale da trattare

9 Sterilizzazione mediante calore Per tutti i microrganismi esiste una temperatura massima di crescita oltre la quale muoiono A temperature elevate le macromolecole perdono struttura e funzionalità per un processo chiamato Denaturazione

10 Effetto della temp sulla vitalità di un batterio mesofilo: il 10% delle cellule rimarrà vivo dopo 3 minuti a 70, 12 min a 60, 42 min a 50

11 Questo concetto di tempo necessario per poter distruggere dei microrganismi è fondamentale per la sterilizzazione Infatti il tempo di sterilizzazione sarà più lungo a temperature inferiori e più breve a temperature maggiori Una sterilizzazione efficace sarà considerata tale solo se temperatura e tempo saranno ottimali Altro concetto importante è il tipo di calore utilizzato che può essere secco o umido Il calore umido è sicuramente il più efficace in quanto ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco e permette di ottenere a parità di temperature e tempo una riduzione più rapida del numero dei microrganismi vitali

12 Il parametro utilizzato per caratterizzare la sterilizzazione mediante calore è il Tempo di riduzione decimale D: tempo necessario per ridurre di dieci volte, a una data temperatura la densità di popolazione a. Organismo mesofilo, sono necessari 20 sec a 110 C, b. per un termofilo servono 10 min alla stessa temperatura

13 Il tempo di riduzione decimale non è però facile da determinare per cui si preferisce utilizzare il concetto di Tempo di inattivazione termica: tempo necessario per uccidere tutte le cellule di una popolazione ad una data temperatura Il tempo di inattivazione termica viene determinato sottoponendo ad una fonte di calore popolazioni microbiche diverse Inoltre dipende anche dalla grandezza della popolazione microbica > è la popolazione maggiore dovrà essere il tempo e viceversa

14 Strumenti utilizzati per la sterilizzazione mediante calore 1. Autoclave (calore umido) 2. Pentola di Kock (calore umido) 3. Stufa di Pasteur (calore secco)

15 1. Autoclave: è una camera chiusa ermeticamente che permette l immissione di vapore saturo sotto pressione La normale procedura prevede il riscaldamento a una pressione di 1,1 Kg/cm 2 che permette una temperatura di 121 C Questa è la temperatura che permette di raggiungere la sterilizzazione in minuti Concetto fondamentale: non è la pressione a provocare la morte dei microrganismi ma l elevata temperatura che può essere raggiunta in condizione di vapore a una pressione superiore a quella atmosferica

16

17 Ciclo di sterilizzazione: la temperatura dell oggetto sterilizzato aumenta più lentamente della temperatura dell autoclave

18 Tipica autoclave da laboratorio coperchio manometro termometro cestello

19 2. Pentola di Kock (calore umido) Funziona come una pentola con acqua calda, quindi la temperatura non supera mai i 100 C Si usa per composti termolabili che non possono essere scaldati a temperaure superiori ai 100 C Sterilizzazione frazionata o tyndalizzazione: In presenza di ingredienti termolabili si può ricorrere alla sterilizzazione frazionata, che consiste in un trattamento al calore del materiale termosensibile con vapore fluente (100 C) per 30 e per 3 giorni consecutivi (pentola di Koch). Le endospore non vengono uccise a 100 e trovandosi in ambiente favorevole, immediatamente dopo il raffreddamento del mezzo cominciano a germinare, ciò rende le cellule più suscettibili al calore nel trattamento del giorno successivo.

20 3. Stufa di Pasteur (calore secco) Viene utilizzata quando è indesiderabile che il vapore in pressione giunga a contatto con il materiale che stiamo utilizzando Viene normalmente utilizzata per vetreria e strumenti in metallo Temperatura 150 C per 2-4 ore

21 Differenze fra i diversi metodi di sterilizzazione mediante calore Calore umido: Coagulazione delle proteine; le forme sporali vengono distrutte in minuti Calore secco: ossidazione dei costituenti chimici; forme sporali distrutte in ore calore secco (per vetreria, strumenti in metallo): in stufa a circolazione d aria, con il materiale avvolto in fogli di alluminio, carta speciale o in contenitori: 150 C, 90 min o 180 C, 60 min. calore umido (per substrati, vetreria, materiali in plastica): in autoclavi verticali o orizzontali: 121,1 C (1 atm di sovrappressione) per min.

22 Pastorizzazione È un processo che riduce la popolazione microbica di alimenti che non possono essere trattati ad alte temperature. Prende il nome da Louis Pasteur I termini sterilizzazione e pastorizzazione non sono sinonimi in quanto con la seconda non si ha la totale distruzione dei microrganismi a causa delle temperature più basse Con la pastorizzazione si eliminano solo i microrganismi patogeni La pastorizzazione del latte avviene facendo passare i latte stesso attraverso uno scambiatore di calore a. Pastorizzazione istantanea: 71 C per 15 sec b. Pastorizzazione di massa: 65 C per 30 min

23 Sterilizzazione mediante radiazioni Le radiazioni elettromagnetiche sono una via efficace per il controllo della crescita microbica Si conoscono: 1. Raggi UV 2. Raggi X 3. Raggi γ Le radiazioni agiscono sull organismo con il quale vengono a contatto rompendone il DNA, e portando così l organismo stesso alla sua morte

24 STERILIZZAZIONE MEDIANTE LE RADIAZIONI Vengono utilizzate: Radiazioni ionizzanti- raggi γ, i raggi X emessi da materiale radioattivo posseggono una tale energia da determinare l allontanamento di elettroni da molecole organiche. Efficaci sterilizzanti, utilizzati per materiale plastico termolabile. Necessarie opportune precauzioni. Radiazioni UV: effetto germicida dovuto alla capacità del DNA di assorbire a nm. Utilizzati per sterilizzare l aria in ambienti confinati. In realtà è disinfettante in quanto alcune spore resistono agli UV. Inoltre potere di penetrazione modesto, non passano attraverso il vetro, la plastica, le soluzioni dense.

25

26 Sterilizzazione per filtrazione La sterilizzazione per filtrazione è un metodo molto efficace per sterilizzare liquidi che sono sensibili al calore I filtri sono sostanze con pori troppo piccoli per il passaggio dei microrganismi, ma abbastanza larghi per il passaggio di liquidi e gas Le dimensioni dei pori per evitare il passaggio dei M.O. non devono essere superiori a 10 µm ne inferiori a 0,2 µm

27 Tipi di filtri 1. Filtri a spessore: costruiti con strati fibrosi di carta, lana di vetro, amianto. Le particelle rimangono intrappolate nei pori tortuosi che si creano. Vengono utilizzati come pre-filtri

28 2. Membrane filtranti: sono i tipi di filtri più comunemente utilizzati in microbiologia, sono costituite da dischetti di acetato o nitrato di cellulosa. Sono costruite in modo che le dimensioni dei pori siano ridottissime. La loro funzione è simile ad un setaccio

29 3. Filtri tipo Nucleopore: utilizzati in microscopia a scansione per la facilità con la quale il microrganismo può essere rimosso. Si ottengono trattando un sottile strato di policarbonato con radiazioni nucleari e poi con un composto chimico corrosivo. Il diametro dei pori può essere controllato dosando il composto chimico

30 Uso delle membrane filtranti Parte preventivamente sterilizzata con calore

31

32 Metodi chimici per il controllo della crescita microbica Tutti i giorni sia a casa che a lavoro si utilizzano dei prodotti chimici quali saponi, detergenti la cui funzione è quella di limitare la crescita microbica Agente antimicrobico: composto chimico naturale o di sintesi che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita Gli agenti che uccidono hanno il suffisso cida Battericidi Fungicidi Virocidi

33 Gli agenti che inibiscono ma non uccidono i microrganismi hanno il suffisso statico Batteriostatici Fungistatici Virostatici Gli agenti antimicrobici possono o no avere una tossicità selettiva. La tossicità selettiva è molto utile per il trattamento delle malattie infettive in quanto è possibile uccidere i microrganismi senza danneggiare l ospite (es. antibiotici)

34 Effetti sulla crescita degli agenti antimicrobici Le modalità di azione possono essere diverse a seconda che l agente sia statico, -cida o litico Gli -statici agiscono sulla sintesi proteica, inibendola (molti antibiotici funzionano così) I -cida provocano la morte della cellula senza provocarne la lisi I -litici determinano la morte della cellula per lisi cellulare, si ha la distruzione fisica delle cellule (azione di antibiotici quali la penicillina)

35 Le tre possibilità di azione degli agenti antimicrobici. Al tempo indicato dalla freccia, ad una coltura in fase esponenziale è stata aggiunta una concentrazione di agente inibente per la crescita. Notare la relazione fra conta totale e conta vitale

36 Misura dell attività antimicrobica L attività antimicrobica si misura determinando la concentrazione più bassa del composto in esame necessaria per inibire la crescita di un dato organismo Questo valore viene detto MIC: Minimun Inhibiting Concentration (minima concentrazione inibente)

37 Concentrazioni sempre maggiori di antibiotico vengono aggiunte ad una serie di provette inoculate ed incubate

38 Antisettici, disinfettanti, sterilizzanti Antisettici: composti chimici che possono provocare la morte o inibire la crescita dei MO. Sono poso tossici per l uomo. Vengono utilizzati per disinfettare mani e ferite superficiali Alcool (solubilizza i lipidi) Composti contenenti fenolo (distrugge la membrana cellulare) Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana) Perossido d idrogeno (agente ossidante) Composti iodofori (agente ossidante) Nitrato d argento (precipita le proteine)

39 Disinfettanti e sterilizzanti: provocano la morte dei MO e vengono usati per oggetti inanimati. Sono chiamati anche germicidi Alcool (solubilizza i lipidi) Cloro gassoso (agente ossidante) Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana) Composti clorati (agente ossidante) Solfato di rame (precipita le proteine) Ossido di etilene (agente achilante) Formaldeide (agente achilante) Composti fenolici (denaturano le proteine) Acido peracetico (forte agente ossidante)

40 MODALITA AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI Danneggiamento della parete cellulare: alcuni gram positivi sono attaccati dall enzima lisozima presente nelle lacrime, nei leucociti. Enzimi prodotti da parecchie specie di batteri sono capaci di degradare la struttura della parete cellulare di altre specie. La disintegrazione è seguita dalla lisi. Altre volte l effetto antimicrobico è dovuto all inibizione della sintesi della parete. (Es. penicillina) Antimetaboliti: interferenza in una biosintesi specifica. Es. blocco della sintesi dell acido folico da parte della solfaniddamide.

41 MODALITA AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI Alterazione della permeabilità cellulare: la membrana plasmatica preserva l integrità dei costituenti cellulari. Alcune sostanze (composti fenolici) distruggono la permeabilità selettiva della membrana, permettendo la fuga dei costituendi cellulari. Inibizione dell attività enzimatica: Ciascuna delle centinaia delle reazioni è un potenziale bersaglio per un inibitore. Es. il fluoruro inibisce la glicolisi, l arsenico trivalente il ciclo di Krebs. Inibizione sintesi acidi nucleici:due categorie inibiscono la sintesi degli acidi nucleici 1.Composti che interferiscono con la formazione delle basi 2.Composti che interferiscono con la polimerizzazione.

42 Agenti antimicrobici utilizzati in vivo Sono classificati in base alla loro struttura e del loro meccanismo di azione. La loro caratteristica fondamentale è la TOSSICITÀ SELETTIVA Cioè la capacità di inibire batteri o altri patogeni senza produrre danni collaterali nell ospite. Vengono chiamati anche agenti chemioterapici Due grandi categorie: Composti sintetici Antibiotici

43 Principali bersagli dei chemioterapici

44 Agenti chemioterapici antifungini: essendo i funghi degli eucarioti, gli agenti antibatterici non funzionano

45 Spettro d azione antimicrobica di alcuni agenti chemioterapici