* )'{z \ t_ ir ; - i4i Y.- z $jit,r i.,,, ii ji'''.: UNtvt'RSII A t)t,(ìt.t S ttint DI StfrNA DIPARTIMENTO di FISIOPATOLOGIA. MEDICINA SPERIMENTALE e SANITA PUBBLICA Vr,r Ar.o<l Mono 53100 Srr,NA- I lal.v - ; Sr,c;nr,'1l,nra :39 057'7 23400;t - 2i.l l95 - l)rnr,zroxi,, 2.3402l - I:',rr 2i4009 Scheda di presentazione del progetto Titolo del progetto: Ruolo di fattori individuali nella risposta polmonare al fumo di sigaretta. Studio in modelli animali Obiettivi del Progetto: Individuazione di determinanti genetici per l'insorgenza del danno polmonare indotto da fumo di sigaretta in modelli animali per studi patogenetici e per individuare modelli di uso pre-clinico. (Approvato dal Comitato Etico di Ateneo, il giorno 09.05.2005, Protocollo 230105 del 1.3.05 n.8) Responsabile del raggiungimento degli otriettivi del progetto: PROF. GIUSEPPE LLINGARELLA Descrizione del progetto di ricerca (per il quale è necessarial'attivazione della presente richiesta) in termini di: 1) impatto su altre linee di ricercal 2) impatto sulle strutture organuzative coinvolte nel progetto. E' noto che solo il l5-20vo dei forti fumatori sviluppa una COPD. Fattori individuali fra cui la protezione antiproteasica e/o una differente suscettibilità al danno da agenti ossidanti possono predisporre allo sviluppo del danno alveolare legato al fumo. Scopo principale del Progetto di Ricerca è lo studio delle variazioni dell'espressione genica globale dell'epitelio polmonare in risposta al trattamento con fumo di sigaretta al fine di arrivare all'identificazione di prodotti genici responsabili della sensibilità di particolari ceppi murini allo sviluppo di COPD indotta da trattamento cronico con fumo di sigaretta (Cavarra et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164, 886-890, 2OO1; Bartalesi et al., Eur. Respir. J.,25,15-22,2005). Lo studio sarà effettuato su ceppi murini con deficit di vario grado di protezione antiproteasica e/o antiossidante, e che presentano una differente suscettibilità allo sviluppo di lesioni polmonari indotte da fumo. Levariazioni nell'espressione genica globale e le modificazioni post-traduzionali saranno studiate in relazione con lo sviluppo di lesioni indotte da fumo mediante tecnica della Proteomica.
L In particolare, nella prima fase di questo programma (primi 24 mesi) lo studio sarà condotto su ceppi wild type. Saranno definiti gli end point morfologici rilevabili dopo esposizione cronica al fumo di sigaretta e sarà effettuata l'analisi proteomica sui lavaggi broncoalveolari e sul tessuto polmonare di topi a vari tempi dopo esposizione cronica a fumo di sigaretta. Mediante analisi differenziale dei tracciati sarà possibile individuare variazioni quantitative (aumento/decremento) e qualitative (presenza/assenza; o ossidazioni) di proteine o polipeptidi che nelle varie fasi di sviluppo delle lesioni caratterizzano la risposta di topi suscettibili (C57 B116 e DBAIZ) o non suscettibili (129) al danno polmonare indotto da fumo di sigaretta. Saranno inoltre studiati nei BAL e nel tessuto polmonare i prodotti di geni la cui espressione risulterà modificata, mediante immunoistochimica, ibridizzazione in situ, RPA, real-time PCR e tecniche biochimiche analitiche (HPLC, spettofotometria, fluorimetria, gas massa) atte a determinate attività enzimatiche, inibitorie, di composti e sistemi che partecipano al bil ancio ossidanti/antiossidanti. Nella seconda fase di questo programma (3' e 4" anno) lo studio sarà condotto su mutanti spontanei e in ceppi geneticamente modificati. Saranno definiti anche in questi animali gli end point morfologici rilevabili dopo esposizione cronica al fumo di sigaretta e sarà effettuata I'analisi proteomica sui lavaggi broncoalveolari e sul tessuto polmonare a vari tempi dopo esposizione cronica a fumo di sigaretta. Saranno inoltre studiati nei BAL e nel tessuto polmonare i prodotti di geni la cui espressione risulterà modificata, mediante immunoistochimica, lbridizzazione in situ, RPA, real-time PCR e tecniche biochimiche analitiche (HPLC, spettofotometria, fluorimetria, gas massa) atte a determinate attività enzimatiche, inibitorie, di composti e sistemi che partecipano al bilancio ossidanti/antiossidanti. Nella terza fase di questo programma (5' anno), sulla base dei dati ottenuti nelle due fasi precedenti saranno selezionati quei ceppi murini sui quali condurre a tempi brevi (giorni) ed intermedi (poche settimane) dall'inizio del trattamento con fumo di sigaretta lo studio sui possibili marker precoci di danno polmonare e su potenziali target terapeutici. In definitiva, i risultati provenienenti da tale Progetto di Ricerca potranno far luce sui quei fattorr biologici importanti nella patogenesi della COPD indotta da fumo di sigaretta e potranno identificare nuovi target molecolari di potenziale importanza terapeutica. Metodologie l) Animali. In questo studio verranno usati topi maschi, di2 o 3 mesi di età, dei ceppi C57Bll6J, DBAI2 ed 729, e di loro mutanti spontanei o geneticamente modificati.
J 2) Esposizione al fumo di sigaretta. I topi saranno esposti a fumo di sigaretta (sigarette Virginia: 12 mg di tar and 0.9 mg di nicotina) in accordo con quanto da noi precedentemente descritto (Cavarra e coll. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164,886,2001). Topi di controllo saranno esposto ad aria atmosferica con le stesse modalità. Gli animali saranno sacrificati a vari tempi di trattamento per le analisi biomolecolari, biochimiche e morfologiche. 3) Morfologia e morfometria. Gli esami morfologici e morfometrici dei polmoni verranno eseguiti al microscopio ottico a vari tempi del trattamento cronico con fumo di sigaretta. L'esame morfometrico sarà basato sulla misurazione delle intersezioni lineari medie (Lm), della superficie interna del polmone (lsa) e dell'indice di distruzione (DI). 4) Proteoma. L'insieme dei prodotti polipeptidici primari e delle modificazioni post-traduzionali saranno caraîterizzati nei BALF e nel tessuto polmonare mediante elettroforesi bidimensionale ed anaf isi computerizzata dei tracciati elettroforetici mediante software Melanie 3 e ImageMaster in accordo con quanto riportato da Bini et al. (Biochem J. 369:301-309,2003). Gli spot ottenuti che sarranno identificati mediante analisi delle banche dati, spettrometria di massa o immunorivelazione. 5) Immunoistochimica,lbridizzazione in situ, RNAse Protection Assay (RPA) e real-time PCR. A vari tempi dal trattamento sarà studiata, mediante immunoistochimica la presenza e la distribuzione nel parenchima polmonare di prodotti proteici, appartenenti a vari clusters genici (enzimi, inibitori, fattori potenzialmente importanti nella regolazione del bilancio ossidanti/antiossidanti, la cui espressione risulterà modificata dopo analisi proteomica. Con la successiv applicazione delle tecniche lbridizzazione in situ e di real-time PCR, saremo in grado di definire quali delle variazioni osservate in proteomica sono imputabili a modificazioni post-traduzionali o variazioni di espressione genica indotte da fumo di sigaretta. L'attivazione della presente richiesta e la disponibilità di un tecnico con provata esperienza nel campo della Morfologia, Morfometria, Immunoistochimica ed Ibridizzazione in situ è necessaria sia nelle prime fasi del progetto per definire gli endpoint morfologici rilevabili dopo esposizione cronica al fumo di sigaretta, sia nella fase di validazione dei dati ottenuti dopo analisi molecolare (RTPCR e RPA) e proteomica per individuare le differenti risposte delle varie componenti cellule polmonari al fumo di sigaretta. La disponibilità di tale unità di personale avrà comunque un impatto importante sulle altre lineee di ricerca attualmente condotte dai docenti proponenti che prevedono l'utilizzo di tecniche morfologico-morfbmetriche, e di immunoistochimica. (Tali ricerche sono state approvate dal Comitato Etico di Ateneo, il giorno 09.05.2005, Protocollo 230105 del 01.03.05: N. 4, 5, 6, 7)
4 Altri sossetti beneficiari dei risultati del Descrizione sogsetti beneficiari Comunità Scientifica o Descrizione impatto Individuazione di meccanismi patogenetici e determinanti genetici legati al danno polmonare causato da fumo di sisaretta I ndustrie farmaceutiche Ptealizzazione di modelli di malattia utili per studi farmacologico-preclinici. Individuazione di potenziali target terapeutici Termini previsti per la realizzazione del progetto Dafa inrzio 15 Maggio 2007 Data ultimazione l4maggro 2012 Durata del progetto 60 mesi Quadro 1: risorse umane, strumentali e servizi coinvolti Le persone presenti nel Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica, e coinvolte nella ricerca in questione sono rappresentate da no 3 unità di personale docente, 4 dottorandi di ricerca in Medicina Molecolare (con sede amministrativa nel Dipartimento), n. 1 unità di personale tecnico. Il personale docente afferente al Dipartimento e coinvolto in tale ricerca nella realizzazione di tale progetto e per la sua intera durata e rappresentato dal Prof. Giuseppe Lungarella (Professore Ordinario), Dr.ssa Eleonora Cavarra (Ricercatore Confermato) e dalla Dr.ssa Monica Lucattelli (Ricercatore Confermato). I beni utilizzatr sono patrimonio del Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimental e Sanità Pubblica parte integrante dei 3 laboratori destinati a tale ricerca (Lab. di Morfologia ed Istochimica, Lab. Biochimica, Lab. Biologia Molecolare) e di laboratori ad uso comune che contengono strumentazione di base, e non,utllizzate dai vari gruppi scientifici operanti nel Dipartimento. Il valore complessivo di tali strumentazione si aggira sui trecentomila euro e comprende tra l'altro: Spettrofotometri, Fluorimetri, Ultracentrifuga e Centrifighe Preparative, Microscopio a Fluorescenza, HPLC, lettore di piastre ELISA, apparato per Real Time PCR, citocentrifuga, microtomi, ed apparti
per elettrofiresi mono e bidimensionale, e tutti gli apparati relativi al trattamento sperimentale degli animalidi laboratorio. Tra i servizi utilizzafi di particolare rilievo è lo Stabilimento di Allevamento e Stabulazione gestito il cui personale è direttamente gestito dal Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimental e Sanità Pubblica. ro 2. Risorse umane coinvolte Professionalità individuata Titolo di studio Attività da svolgere all'interno del progetto Profèssionalità di areea tecnicoscientifica esperta in tecniche istopatologich ed immunoi stochimiche applicate alla patologia polmonare E' richiesta inoltre una buona conoscenza della linsua inslese "Diploma Universitario o Laurea " Prelievo di organi ed allestimento di preparati per istochimica, immunoistochimica, lbridizzazione in situ. e analisi morfometriche. Quadro 3. Programmazione pluriennale delle attività Descrizione fasi e sottofasi del Progetto I o Fase del Prosetto: studio cronico in ceppi wild type 1o Sottofase (1o Anno) Definizione degli end point morfologici rilevabili dopo esposizione cronica al fumo di sigaretta e completamento dell'analisi proteomica sui lavaggi broncoalveolari e sul tessuto polmonare di topi wild type a vari tempi dopo esposizione acuta o cronica a fumo di sigaretta.. morfologia. morfometria. proteomica Data prevista inizio attività 15 Maggio 2007 Data prevista fine attività t4maggio 2008 Note Studio in ceppi wild type 1o Fase del Prosetto: studioexuico in ceppi wild type 2o Sottofase (2" Anno) Studio nei BAL e nel tessuto polmonare di topi wild type di prodotti di geni, la cui espressione risulterà modifi cata.. immunoistochimica,. lbrrdizzazione in situ- 15 Maggio 2008 14 Maggio 2009 Studio in ceppi wild type
. RPA,. real-time PCR. determinazione di attività enzimatiche ed inibitorie,. determinazioni del bilancio o ssidanti/antio ssidanti. 2o Fase del Prosetto: studio cronico in mutantr spontanqle 1@ modificati I o Sottofase (3o Anno) Definizione degli end point morfologici rilevabili dopo esposizione cronica al fumo di sigaretta e completamento dell'analisi proteomica sui lavaggi broncoalveolari e sul tessuto polmonare di topi geneticamente modificati e in mutanti spontanei a vari tempi dopo esposizione acuta o cronica a fumo di sigaretta.. morfblogia. morfometria. oroteomica 2o Fase del Prosetto: studio cronico rn mutanti spontanei e in ceppi geneticamemnte modifrcati 2" Sottofase (4o Anno) Studio nei BAL e nel tessuto polmonare di topi geneticamente modificati e in mutanti spontanei di prodotti di geni, la cui espressione risulterà modifìcata.. immunoistochimica,. rbridrzzazione in situ,. RPA,. real-time PCR. determinazione di attività enzimatiche ed inibitorie.. determinazioni del bilancio ossidanti/antiossidanti. 3o Fase del Progetto: studio acuto Unica fase (5o Anno) Studio nei BAL e nel tessuto polmonare, a tempi brevi (giorni) ed intermedi (poche settimane) dall'inizio del trattamento con fumo. di prodotti di eeni la cui espressione è 15 Maggio 2009 15Maggio 2010 l5 Maggio 20tl t4maggio 2010 t4maggio 20r1 14 Maggio 20t2 Studio in mutanti spontanei e in ceppi geneticamemnte modificati Studio in mutanti spontanei e in ceppi geneticamemnte modificati Studio condotto in ceppi selezionati dopo le prime due lasi del Progetto
risultata modificata dopo trattamento cronlco con fumo di sigaretta.. immunoistochimica,. rbridrzzazione in situ". RPA,. real-time PCR. determinazione di attività enzimatiche ed inibitorie.. determinazioni del bilancio ossidanti/antio ssidanti. Approvato dal Consiglio di Dipa4fimeytg con delibera n.... delfr.f:.4:l - kf,,6 esponsabile del la-4< Il Direttore del Dipartimento /ffit.\lryv'n