UTILIZZO DI LIQUIDI BIOLOGICI URINARI NEGLI ACCERTAMENTI TOSSICOLOGICI Dott.ssa Barbara Candiani Giuristi&diritto.it dirittoi fattori che influenzano il risultato derivante da test preliminari su matrice biologica urinaria sono vari, a prescindere dell importanza delle condizioni di salute dell individuo. Tra questi: la quantità e lo schema metabolico della sostanza assunta; la frequenza dell uso; il tempo intercorso tra il prelievo e l ultima assunzione; la sensibilità della metodica e la scelta del cut off; la concomitante assunzione di più sostanze, la presenza di sostanze o condizioni interferenti. E noto infatti che alcune sostanze e farmaci possono interferire con test immunochimici dando un esito falsamente positivo per la sostanza ricercata. Inoltre, l utilizzo di un test sulle urine deve basarsi sulla consapevolezza che il risultato analitico dipende anche dalle modalità e condizioni del prelievo del campione, dalle verifiche operate dal personale di laboratorio per assicurare l integrità del campione e la sua esatta identificazione. L urina, rispetto al sangue, rappresenta la matrice di elezione per il test di screening delle droghe d abuso. Il suo uso presenta indubbi aspetti vantaggiosi; infatti, l urina è un normale prodotto dell organismo, a differenza del sangue consente un prelievo semplice e non invasivo, da la possibilità di campionare grandi volumi e inoltre la droga e i suoi metabolici sono facilmente dosabili in un veicolo acquoso e si trovano nelle urine più a lungo che nel sangue, anche a distanza di alcuni giorni dall assunzione. D altra parte, soprattutto in campo di analisi tossicologiche con finalità diagnostiche medico legali, è importate, per una giusta interpretazione del dato analitico, tener sempre presente gli svantaggi legati all uso di tale matrice quali: l urina contiene molte sostanze che possono in qualche modo interferire ed essere responsabili di eventuali falsi positivi o falsi negativi; scarsa rilevanza clinica delle concentrazioni trovate in questo liquido biologico; infatti la concentrazione urinaria di un determinato metabolita non è direttamente correlabile alla concentrazione dello stesso metabolita nel siero, poiché la concentrazione urinaria di ogni sostanza è enormemente influenzata dal volume urinario, che a sua volta dipende dalla quantità di acqua assunta, dall attività fisica svolta, dallo stato di salute del soggetto, dalle condizioni
climatiche. Così al variare della quota escreta cambierà anche la concentrazione della droga ed il dosaggio della stessa sarà più o meno influenzato da sostanze interferenti presenti nell urina campione, poiché anch esse risentono della concentrazione urinaria. l urina può essere facilmente adulterata causando così l invalidazione del risultato analitico mediante: sostituzione del campione con liquidi simili all urina (thè, succhi di frutta, soluzioni saline ecc.) o con un campione sicuramente negativo recuperato da un donatore; metodi in vivo che consistono nell assunzione, da parte del soggetto che dovrà affrontare l analisi, di grandi quantità di liquidi, associati o meno a diuretici, prima della raccolta del campione di urina, producendo così una diluizione e quindi una riduzione della concentrazione delle sostanze da ricercare che potranno scendere al di sotto dei valori soglia e generare un risultato negativo. metodi in vitro, che consistono invece nell aggiungere alle urine, al momento della raccolta, sostanze che ne variano il volume o le sue caratteristiche chimico fisiche. Da quanto precedentemente esposto si capisce come l identità, l autenticità e l integrità di un campione di urina, unitamente all esecuzione, prima, di test analitici preliminari (da eseguire entro pochi minuti dal campionamento come la valutazione del colore, del ph, nitriti, gluteraldeide, ossidanti, misura della densità, temperatura, dosaggio creatinina urinaria), successivi test analitici di screening immunochimici (come EMIT, RIA, FU, FPIA, sistemi dotati di ampio range dinamico e della possibilità di variare il cut off adeguandolo alle finalità del dosaggio) e se necessario successivi test analitici di conferma (HPLC; GC meglio GC MS) siano, nella ricerca di laboratorio delle sostanze di abuso presupposti indispensabili per l attendibilità dei risultati analitici ottenuti. Quanto detto ancor più, quando il risultato semiquantitativo ottenuto con il metodo di screening è appena sopra o sotto il valore di cut off; infatti solo l analisi di tutti i parametri precedentemente menzionati, consentirà all operatore una valutazione più accurata e critica del dato analitico e di conseguenza, una corretta interpretazione dello stesso evitando così l errore di considerare come francamente positivi o francamente negativi campioni che sono in realtà appena al di sotto o al di sopra di un valore soglia. Importante quindi disporre di adeguate procedure operative standard e di adeguati procedimenti analitici. Fondamentale è l istituzione di una Catena di Custodia che documenti la storia cronologica del campione dal momento della raccolta fino alla refertazione del risultato.
L integrità, l identità e l autenticità dell urina da analizzare devono essere garantite già all origine da un corretto procedimento per l ottenere il campione. Tali linee guida sono state elaborate e proposte dal Gruppo di lavoro istituito presso il Ministero della Salute nel giugno 2001 del Gruppo Tossicologi Forensi della Società Italiana Legale e delle Assicurazioni. In tale articolo come riportato nel Riassunto dello stesso, Vengono elencate nei dettagli le procedure operative per la raccolta, la conservazione e l analisi tossicologica e medico legale con particolare riguardo per la sicurezza e la catena di custodia oltre che per l adozione di procedure analitiche certificate ed i controlli di qualità. Le linee guida sono frutto di un consensus allargato che ha coinvolto società scientifiche ed esperti. Al paragrafo 6. Sicurezza e catena di custodia, dell articolo in oggetto, sono riportate le modalità da adottare necessariamente, affinché il campione biologico urina sia raccolto in sicurezza e sia ben identificato. Qui evidenziamo i seguenti punti: punto 6.3.3.: I compiti del personale che sovrintende o esegue il prelievo, che prevedono:..; l apposizione della firma sulle etichette e sulla sigillatura dei contenitori utilizzati; la Dichiarazione di integrità e di corretta identificazione dei prelievi rilasciata dall interessato;.. punto 6.3.6. Le modalità di identificazione del prelievo, devono garantire: l identificazione del prelievo tramite l apposizione sui contenitori (all atto del prelievo ed alla presenza dell interessato) delle etichette di riconoscimento e di quelle di sigillatura, ciascuna contrassegnata col numero di protocollo di ingresso e firmata per esteso dall interessato, omettendo il nominativo ove è richiesto l anonimato; le aliquote destinate all analisi di conferma e/o di revisione devono essere predisposte con procedure che consentano all interessato, ed al personale di laboratorio, la verifica dell integrità del campione conservato ; Stabilire se l urina escreta è concentrata o meno
Per quanto riguarda il punto in oggetto, per minimizzare, l effetto di concentrazione o diluizione delle urine sul risultato, è sufficiente correlare il valore di concentrazione della droga, ottenuto con il metodo di screening, con quello della creatinina urinaria (la cui escrezione è costante), secondo il seguente rapporto Droga ng / ml o mcg / ml creatinina mg / ml Il valore ottenuto in ng o mcg di droga / mg creatinina, non risente delle eventuali variazioni di concentrazioni delle urine. CONSIDERAZIONI SUL METODO DI SCREENING I metodi di screening, detti non a caso presuntivi, sono test che permettono di analizzare in tempi brevi numerosi campioni di urina in maniera economica, efficace e standardizzata. Trattasi di metodi immunochimici, alcuni dei quali in grado di fornire risposte solo di tipo qualitativo (negativo/positivo) altri chiaramente più vantaggiosi, sono quelli che forniscono un risultato numerico da intendersi semiquantitativo. Tra questi il metodo FPIA (immunoflorescenza a luce polarizzata) dotato di un ampio range dinamico e della possibilità di variare il cut off del sistema adeguandolo alle finalità del dosaggio. Ogni metodo comunque, dovrà tener conto di alcune caratteristiche quali: specificità, sensibilità, precisione accuratezza dei risultati; valore soglia (cut off) e particolare attenzione merita il carry over o trascinamento cioè quando un risultato positivo (valore numerico appena sopra il cut off) è causato da insufficiente lavaggio della sonda dello strumento, passando da un campione più
concentrato ad un altro povero o addirittura privo dell analita ricercato. Tale causa di errore, non rara in tale procedure analitiche, potrà essere valutata confrontando nell insieme i risultati analitici ottenuti per i campioni sottoposti ad analisi in serie dispensati cioè nello stesso carosello dello strumento. Tali procedure analitiche consentono comunque di escludere da un ulteriore approfondimento diagnostico i campioni negativi considerati tali quelli che non contengono sostanze della classe in esame o quelli in cui la relativa concentrazione è al disotto del valore soglia cut off. PROCEDERE A TEST DI CONFERMA Il campione risultato francamente positivo al test iniziale immunologico che tiene conto anche dei test preliminari, dovrà necessariamente essere sottoposto a test di conferma affinché il risultato abbia valore medico legale. Il risultato analitico ottenuto con metodo immunochimico non può essere confermato con un altro metodo immunochimico anche se basato su principi di rivelazione differenti e caratterizzato dall impiego di anticorpi dotati di differente specificità (quanto detto è riportato al punto 7.5.3. dell articolo allegato Linee Guida ). I test di conferma, devono infatti avere particolari caratteristiche: essere specifici per il singolo analista per ovviare alla non specificità dei test immunochimici (compreso i test EIA e FPIA); devono basarsi su principi chimici e fisici diversi da quelli dei test di primo livello; devono essere dotati di una sensibilità pari o superiore al valore soglia stabilito nei test di primo livello; il valore soglia dei test di conferma deve essere fissato ad un valore più basso rispetto a quello fissato per lo screening poiché nel test di conferma si va a confermare il singolo metabolita e non una famiglia di metaboliti come nei metodi di primo livello. Le tecniche di conferma utilizzate sono quelle cromatografiche, che rendono possibile l identificazione delle singole sostanze sfruttandone le diverse e peculiari proprietà chimico fisiche. La tecnica di cromatografia in HPLC insieme a quella gas cromatografica (GC) sono quelle solitamente utilizzate poiché meno costose, di più facile utilizzo e perciò più diffuse nei laboratori
di analisi, ma la metodologia di elezione, per la conferma delle sostanze di abuso è senza dubbio la GAS CROMATOGRAFIA accoppiata alla SPETTROMETRIA DI MASSA (GC MS o GC MS MS) ed è la tecnica consigliata dalle Linee Guida e considerata di riferimento nell identificare, in modo assolutamente inequivocabile, la presenza di droghe e sostanze psicoattive in campioni biologici soprattutto quando il valore ottenuto con il metodo di screening, come nel caso in oggetto, è di poco superiori o inferiore al valore soglia. Tale tecnica, infatti, unisce le caratteristiche separative peculiari della cromatografia (gas cromatografia o cromatografia ad alta pressione), con la specificità della spettrometria di massa. La gas cromatografia, come anche la cromatografia ad alta pressione, sono tecniche analitiche che consentono la separazione dei vari componenti di una miscela in base alle caratteristiche chimico fisiche degli stessi (peso molecolare, punto di ebollizione affinità chimiche fisiche tra fase stazionaria e fase mobile ecc) che si tradurranno in un diverso tempo di ritenzione (RT: che corrisponde all intervallo di tempo tra l iniezione del campione in colonna cromatografica e il tempo corrispondente al punto di massima risposta del rivelatore) in base al quale gli analiti vengono identificati e quantificati. Nell utilizzo di tale tecnica analitica, non si può certo escludere la possibilità che analiti diversi, di struttura chimica simile, abbiano caratteristiche chimico fisiche uguali e di conseguenza un uguale comportamento cromatografico (uguale tempo di ritenzione) ciò porterebbe l operatore ad identificare in modo errato l analita. Quindi nella tecnica cromatografica, la rivelazione degli analiti non si basa su un metodo assoluto e può essere soggetta ad interferenze per la co eluizione di molecole estranee a quelle indagate. Tale inconveniente è attualmente ovviato con l utilizzo della gas cromatografia abbinata alla spettrometria di massa. Infatti il principio alla base di tale tecnica poggia sul fatto che quando una molecola è investita, in fase di vapore da un fascio di elettronici di notevole energia cinetica, la stessa, in seguito all urto si decompone in una serie di frammenti di massa inferiore, secondo un processo a catena. Ogni molecola avrà quindi una sua frammentazione (finger print) caratteristica e specifica che a condizioni operative costanti dipenderà solo ed esclusivamente dalla sua natura chimica. Quindi l accoppiamento della gas cromatografia alla spettrometria di massa, rendono il metodo estremamente affidabile, dal momento che le sostanze vengono identificate in modo assolutamente inequivocabile, in base alle loro caratteristiche chimico fisiche responsabili di un
determinato RT e ai frammenti chimici (finger print) che si originano per impatto con elettroni prodotti ad alta velocità, presenti nella sorgente ionica dello spettrometro. Tutto ciò unitamente all esperienza analitica dell operatore rendono la GC/MS; GC/MS MS in SIN, le metodologie di elezione per la conferma inequivocabile senza ombra di dubbio, dei metabolici delle sostanze di abuso nei liquidi biologici.