movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti dei sistemi biologici

movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti dei sistemi biologici

membrana cellulare garantisce un ambiente fisico-chimico altamente stabile eucarioti sviluppo endomembrane concentrazione substrati separazione processi incompatibili accumulo cataboliti necessità di controllare la composizione dell ambiente interno in funzione di diverse condizioni ambientali

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Concentrazione di nutrienti minerali essenziali Elemento Simbolo chimico Concentrazione peso secco (µg/g) Concentrazione peso fresco Azoto Potassio Calcio Magnesio Fosforo Zolfo N K Ca Mg P S 15000 10000 5000 2000 2000 1000 71,4 mm 17,0 mm 8,3 mm 5,5 mm 4,3 mm 2,1 mm Cloro Boro Ferro Manganese Zinco Rame Molibdeno Nichel Cl B Fe Mn Zn Cu Mo Ni 100 20 100 50 20 6 0,1 0,005 188 µm 123 µm 120 µm 61 µm 20,4 µm 6,2 µm 0,07 µm 0,006 µm

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI L H è il principale prodotto generato dal metabolismo

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Gli zuccheri prodotti dalla fotosintesi vengono distribuiti dai siti di sintesi a quelli di accumulo secondo meccanismi che prevedono il trasporto di membrana

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Alcuni processi biochimici sono incompatibili tra loro necessità di evitare cicli futili (ex. sintesi amido e glicolisi)

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI fotosintesi e respirazione Il trasporto di membrana è al centro di processi che convertono l energia libera in forme biologicamente utili

IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI stimolo ambientale variazione [Ca 2 ] risposta fisiologica

µ = * j µ RTln C j j z j FE V j P

µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P potenziale chimico di j in condizioni standard

µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della concentrazione

µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della carica elettrostatica

µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della pressione idrostatica

X µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P significativo esclusivamente nei movimenti osmotici dell acqua

DIFFUSIONE spostamento delle molecole secondo un gradiente di concentrazione dovuto ad agitazione termica casuale saccarosio µ i s = µ * s RTln C i s µ o s = µ * s RTln C o s

µ s = µ i s - µ o s = = (µ * s RTln C i s) - (µ * s RTln C o s) = = RT(ln C i s- ln C o s) = s s = RT ln C i s C o s

µ s = RT ln C i s C o s µ s è proporzionale al gradiente di concentrazione All equilibrio µ = 0

In generale per una sostanza x: µ 1 = µ * RTln [X] 1 C 1 C 2 µ 2 = µ * RTln [X] 2 µ = µ 2 - µ 1 = RTln [X] 2 [X] 1 Se [X] 2 < [X] 1 µ < 0 X diffonde spontaneamente verso C 2 Se [X] 2 > [X] 1 µ > 0 X diffonde spontaneamente verso C 1 All equilibrio [X] 1 = [X] 2 µ = 0

µ < 0 il trasporto avviene spontaneamente senza consumo di energia µ > 0 il trasporto non avviene spontaneamente ma solo con consumo di energia TRASPORTO PASSIVO TRASPORTO ATTIVO

PER UNO IONE?

ione K µ ki = µ * RT ln C ki zfe i µ ko = µ * RT ln C ko zfe o C K i µ = RT ln i o K zf(e-e ) C K o dato che z=1 C K i µ K = RT ln F(E i -E o ) C K o

relazione tra il potenziale chimico µ e il trasporto di molecole attraverso una membrana

cosa succede se una membrana ha una permeabilità maggiore per il K che per il Cl -? Il potenziale di membrana che si genera è detto potenziale di diffusione il potenziale di diffusione ritarda l ingresso di K e accelera quello di Cl -

relazione tra il potenziale di membrana e la distribuzione di ioni quando la distribuzione di un soluto attraverso la membrana raggiunge l equilibrio, il flusso passivo (J) è lo stesso in entrambe le direzioni J o i = J i o

All equilibrio per uno ione j µ jo = µ j i µ j* RT ln C jo z j FE o = µ j* RT ln C ji z j FE i E i E o = RT z j F ln C j o C j i E = RT z j F ln C j o C j i

Per uno ione monovalente all equilibrio, la differenza di concentrazione di uno ione tra due scomparti è bilanciata dalla differenza di campo elettrico tra gli scomparti E = RT z j F ln C j o C j i se E = 59 mv E = 59 mv log C j o C j i catione monovalente catione bivalente anione monovalente E = 59 log C j o C j o = 10 C j i C j i E = 59 log C j o 2 C j o = 100 C j i C j i E = -59 log C j o C j o = 0.1 C j i C j i

tutte le cellule possiedono un potenziale di membrana, dovuto alla distribuzione asimmetrica degli ioni tra l interno e l esterno della cellula -240 mv < E > -60 mv

- - - - - - - - - - - - - - - Iperpolarizzazione Iperpolarizzazione della membrana Depolarizzazione Depolarizzazione della membrana E = - 120 mv - - - - - - - - - - - - - - - - E = - 180 mv E = - 60 mv - - - - - - - - - - - - - - -

E = -110 mv la misura della concentrazione dei vari ioni permette di distinguere tra trasporto attivo e passivo

diffusione trasporto attivo

E calcolato con l equazione di Goldman = -50/ 50/-40 mv E E misurato sperimentalmente = -240/ 240/-60 mv

qual è la componente aggiuntiva? CN - aumento ph apoplasto l diminuzione ph citosol l H è lo ione trasportato elettrogenicamente

I potenziali di membrana delle cellule vegetali sono il risultato di due componenti Potenziale di diffusione Trasporto elettrogenico

TRASPORTO PASSIVO µ < 0 il trasporto avviene spontaneamente senza consumo di energia TRASPORTO ATTIVO µ > 0 il trasporto non avviene spontaneamente ma solo con consumo di energia

C j i µ j = RT ln z j F(E i -E o ) < 0 C j o Il trasporto avviene secondo GRADIENTE ELETTROCHIMICO Per una molecola non carica (z j =0) il trasporto dipende solo dal GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE

Confronto dei valori di permeabilità (P) per diverse molecole tra membrane biologiche e artificiali Le membrane biologiche sono più permeabili dei doppi strati lipidici artificiali a ioni, acqua e molecole polari

PROTEINE DI TRASPORTO CANALI CARRIER POMPE

Trasportano ioni Sono specifici per lo ione trasportato La selettività è data dall ampiezza e da cariche di superficie all interno del poro Sono regolati (voltaggio, ormoni, luce, fosforilazione)

due conformazioni: aperti/chiusi Ampiezza del poro e cariche di superficie = selettività

I canali si studiano con la tecnica del PATCH CLAMP

PATCH CLAMP

PATCH CLAMP Le correnti dirette verso l interno della cellula e quelle dirette verso l esterno sono mediate da classi distinte di canali ionici

C K o C K i = 1 10 E = 59 log C j o C j i

Ipotetico canale NON regolato dal voltaggio I canali rettificanti entranti si aprono in condizioni di IPERPOLARIZZAZIONE I canali rettificanti uscenti si aprono in condizioni di DEPOLARIZZAZIONE

I canali per il potassio sono estremamente selettivi Correnti tempo-dipendenti attraverso canali rettificanti entranti per il K Il Na è molto meno permeabile

SENSORE DEL VOLTAGGIO Canale K rettificante entrante di tipo Shaker

trasporto passivo (diffusione facilitata diffusione facilitata) trasporto unidirezionale di ioni e soluti

Il legame con la molecola da trasportare induce un cambiamento conformazionale e il conseguente rilascio della molecola dal lato opposto della membrana la velocità di trasporto è più lenta rispetto ai canali (V canale = 10 6 V carrier )

le cinetiche di attività dei carrier sono descrivibili con l equazione di Michaelis-Menten Menten

PRINCIPALI IONI E SOLUTI TRASPORTATI DA CARRIER NH 4, NO 3-, PO 4 3-, SO 4 2-, zuccheri, amminoacidi, basi azotate alta selettività per la molecola da trasportare

C j i µ j = RT ln z j F(E i -E o ) > 0 C j o Il trasporto avviene contro GRADIENTE ELETTROCHIMICO E necessaria energia

TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO il trasporto è accoppiato a una fonte di energia metabolica idrolisi di ATP reazione di ossidoriduzione POMPE elettrogeniche H -ATPasi (piante, funghi) Na /K -ATPasi (animali) elettroneutre H /K -ATPasi ( mucosa gastrica )

principali pompe elettrogeniche H -ATPasi di membrana plasmatica H -ATPasi vacuolare H -pirofosfatasi (vacuolo, golgi) Ca -ATPasi (membrana plasmatica)

pompe protoniche nelle piante H -ATPasi di plasmalemma H -ATPasi vacuolare H -ATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti H -pirofosfatasi (vacuolo e golgi)

TRASPORTO ATTIVO DI H Gradiente elettrochimico di H ENERGIA LIBERA CHEMIOSMOSI CHEMIOSMOSI: ACCOPPIAMENTO TRA GRADIENTI PROTONICI E LAVORO CELLULARE

il movimento dei protoni secondo il loro gradiente elettrochimico può essere accoppiato al lavoro cellulare µ H = F E 2.3RT log [H ] i [H ] o p = µ H F = E 2.3RT log [H ] i F [H ] o

poiché ph = -log[h ] log [H ] i [H ] o = - (ph i - ph o ) = ph p = E - 2.3RT F ph p = E - 59 ph FORZA PROTON MOTRICE

Processi chemiosmotici

TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO la forza proton motrice può guidare il trasporto di altre sostanze contro il gradiente elettrochimico SIMPORTO protone e molecola X si muovono nella stessa direzione ANTIPORTO protone e molecola X si muovono in direzioni opposte

Ipotetico modello di funzionamento di un simportatore

variazioni del ph e del E in Lemna gibba in seguito all aggiunta di glucosio simporto glucosio-h

flussi del Ca 2 nella cellula vegetale

F-ATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti. Sfruttano il ph per la sintesi di ATP V-ATPasi, presente sul tonoplasto. Pompa i protoni all interno del vacuolo, generando la forza motrice per diversi sistemi di trasporto P-ATPasi, presente sulla membrana plasmatica

CF 1 α 3, β 3, γ, δ, ε CF 0 a, b, b, c 12

V 1 porzione solubile sito catalitico 3 copie subunità 1(β F-ATPasi) 3 copie subunità 2(α F-ATPasi) altre 8 subunità V 0 porzione integrale di membrana canale per H copie multiple subunità 3 (16 kda, =2 X 8 kda subunità c) altre 4 subunità)

H -ATPasi di plasmalemma

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA mantenimento del ph del citoplasma

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA forza guida per sistemi di trasporto di ioni e nutrienti

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA Apertura e chiusura degli stomi

H H H Apertura degli stomi luce blu K Cl - H H H K Cl - Cl - K H H H Iperpolarizzazione della membrana aumento della π apertura canali del K ingresso del Cl - diminuzione di Ψ

H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O Apertura degli stomi AUMENTO DELLA PRESSIONE DI TURGORE

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA movimenti pulvinici

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA Crescita per distensione H H H H H H H H H H H H C IAA H H H H H H H

RUOLO FISIOLOGICO DELL H -ATPasi DI PLASMALEMMA fototropismo

possibili meccanismi che determinano un aumento di attività dell H -ATPasi fattori che influenzano l attività dell H -ATPasi stress salino auxina luce patogeni

il dominio C-terminale è autoinibitorio prove sperimentali - mutanti H -ATPasi senza la regione C-terminale - proteolisi controllata: rimozione regione C-terminale ENZIMA COSTITUTIVAMENTE ATTIVO

Le proteine 14-3-3 sono coinvolte nella regolazione dell attività della H -ATPasi Proteine 14-3-3 Classe di proteine regolatrici diffuse in tutti gli eucarioti Proteine dimeriche. Ogni monomero ha un PM di circa 30 kda Interagiscono con numerose proteine bersaglio, tramite il riconoscimento di particolari sequenze fosforilate su residui di serina o treonina.

La H -ATPasi è attivata dal legame delle proteine 14-3-3 in seguito alla fosforilazione di uno specifico residuo di treonina localizzato all estremità C-terminale dell enzima

fusicoccina La fusicoccina, una fitotossina prodotta da un fungo, è in grado di indurre il legame delle proteine 14-3-3 anche in assenza di fosforilazione dell enzima