CREATININA URINARIA IN UV Codice Z08010 BIOCHIMICA La creatina (dal greco kreas = carne) o metil-glico-ciamina è un componente del metabolismo intermedio che viene formata nel fegato in quantità quasi costante, secondo una reazione che coinvolge gli aminoacidi glicina, arginina e metionina, e che viene depositata per circa il 95% nei muscoli. La sintesi della creatina avviene a partire dagli aminoacidi glicina e arginina, con il contributo della S-adenosil-metionina e mediante la catalisi operata da alcuni enzimi (amidinotransferasi, metiltransferasi) localizzati a livello epatico, pancreatico e renale. Dopo essere stata fosforilata a fosfocreatina, la molecola viene convertita irreversibilmente e non-enzimaticamente in creatinina e, quindi, escreta nelle urine. In tal caso, il turnover di trasformazione della creatina in creatinina è di circa l'1.6% al giorno. La creatina di origine alimentare è contenuta principalmente nella carne, mentre solo in tracce è presente in alcuni vegetali. Nel caso di una dieta priva di creatina, come avviene ad esempio nei soggetti vegetariani, il fabbisogno giornaliero è coperto dalla sola sintesi endogena e l eliminazione urinaria della creatinina risulta molto limitata. Heintz e Pettenkofer evidenziarono nelle urine una sostanza che poi Lieberg confermò essere la creatinina. Sulla base dell osservazione che l escrezione urinaria della creatinina era correlata all entità della massa muscolare, fu ipotizzato che la creatinina fosse un diretto prodotto di metabolizzazione dalla creatina localizzata nei muscoli. Non tutta la creatina somministrata all animale o all uomo si ritrova nelle urine, suggerendo che parte della creatina possa essere trattenuta dall organismo a scopi plastici o energetici. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Release N 007 Creatinina urinaria in UV Marzo 2010 1
CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: La Creatinina viene analizzata previa diluizione con una soluzione diluente e successiva aggiunta di una soluzione stabilizzante. La soluzione così ottenuta viene iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : 0,2 mg/l Valori di normalità nelle urine: Circa 1000 mg/l Range dinamico del metodo : 0,2-5000 mg/l Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( 20 C ). Reagente A Soluzione diluente, 1 x 200 ml Reagente B Soluzione stabilizzante, 1 x 50 ml Reagente C Standard chimico/sol. Test Creatinina, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente M Fase mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale: Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=236 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo urinario: A discrezione del medico richiedente. Fase preanalitica: Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Stabile 4 settimane a 2-8 C o 4 mesi 20 C dopo acidificazione a ph=3.. 2
PROCEDURA PREANALITICA Preparazione della Soluzione Test In una provetta pipettare : 990 µl di Acqua grado HPLC 10 µl di Reagente C Sol. Test INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei campioni. In provette da centrifuga idonee pipettare in sequenza : Bianco Standard Campione Acqua di grado HPLC Reagente C Std chimico Creatinina Campione Reagente A Sol. diluente 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml Reagente B Sol. stabilizzante 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Al vortex per 10 secondi FASE 2 : Centrifugare a 4.000 rpm per 5 minuti. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl del sovranatante nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 007 Creatinina urinaria in UV Marzo 2010 3
CREATININA URINARIA - Avvertenze REAGENTE C : STANDARD CHIMICO CREATININA/SOLUZIONE TEST CREATININA 1.000 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 236 nm 0,01 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ o 0,45 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. Con questo kit NON è consigliabile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 80 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z08020 Standard chimico per Creatinina urinaria 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S394983500 Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 4
CREATININA URINARIA (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 1 Soluzione Test Fig. 2 Campione urinario R.T. 10.761 Creatinina 1000 mg/l R.T. 10.857 Creatinina 605 mg/l 5