Corso di Aggiornamento 19 20 21 Giugno 2012 CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it La Vitrificazione Dott.ssa Giovanna Tomasi
La crioconservazione È una branca della criobiologia che consente il mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di 196 C in azoto liquido. Il principio fondamentale è quello di interrompere i processi biochimici del metabolismo cellulare. Gardner et al. 2004
Crioconservazione Embrionale Cenni storici Gli embrioni dei mammiferi furono congelati e conservati la prima volta con successo nel 1972 quando Whittingham ottenne cuccioli di topo dopo il trasferimento di una morula scongelata. La prima gravidanza da embrione umano - ottenuto con IVF e congelato allo stadio di 8 cellule - fu ottenuta in Australia nel 1983 da Trounson e Mohr, ma esitò in aborto clinico. Nel 1986 Cohen ottenne il primo nato da embrione crioconservato allo stadio di blastocisti ed ottenuta con IVF. Nel 1994 Van der Elst pubblicò la prima gravidanza da embrione crioconservato da ICSI.
Crioconservazione degli Ovociti Cenni storici Wittingham 1977 Carroll 1989 congelamento di ovociti di topo Bassa percentuale di fertilizzazione Alterazione del processo di fecondazione Gli ovociti sono una specie cellulare scarsamente resistente alla crioconservazione
Crioconservazione degli Ovociti Cenni storici Chen 1986 prima gravidanza da ovocita congelato Hunter 1995 vitrificazione di ovociti umani Porcu 1997 primo bambino nato da un ovocita congelato con il congelamento lento Kuleshova 1999 primo bambino nato da un ovocita vitrificato Yoon 2003 il primo a pubblicare uno studio su un gran numero di ovociti vitrificati
Regolamentazione Legislativa La L. 40/2004 consente oggi la crioconservazione di GAMETI ed EMBRIONI. La Sentenza n.151 del 2009 della Corte Costituzionale ha dato una deroga al divieto di congelamento. TUTELA ESCLUSIVA DELL EMBRIONE SCIENZA E COSCIENZA DEL MEDICO TUTELA DELLA SALUTE DELLA DONNA
Indicazioni alla Crioconservazione È possibile crioconservare: Spermatozoi Tessuto testicolare Ovociti Tessuto ovarico Zigoti Embrioni Blastocisti PRESERVARE LA FERTILITA OTTIMIZZARE I RISULTATI DELLA PMA
Vantaggio nei programmi di PMA CONGELAMENTO DEGLI OVOCITI Preserva la fertilità della donna quando la funzionalità del suo apparato riproduttore è compromessa Per le donne che rimandano la maternità per ragioni sociali (carriera o mancanza di un partner)
POF: Fallimento Ovarico Precoce Patologie pelviche Gravi malattie infiammatorie del colon Malattie autoimmuni Trattamenti radioterapici
Crioconservazione Embrionale Transfer degli embrioni con la morfologia ottimale Congelamento degli embrioni con morfologia discreta Percentuale di gravidanza cumulativa maggiore del singolo trasferimento di embrioni freschi Strategia cost-effective per aumentare la percentuale di gravidanza per pick-up. Ridurre il rischio di iperstimolazione ovarica nelle pazienti iper-responsive e PCO. T. Mardešić, 2010
Gardner et al. 2004 La crioconservazione CONTROLLO QUOTA DI RAFFREDDAMENTO QUOTA DI RISCALDAMENTO H 2 O Fondamenti della crioconservazione CRIOPROTETTORE PROTEZIONE DISIDRATAZIONE PREVENZIONE GHIACCIO INTRACELLULARE EQUILIBRIO OSMOTICO E TERMICO INTEGRITA CELLULARE
Gardner et al. 2004 La crioconservazione Esposizione al CRIOPROTETTORE Citotossicità Punti critici Riduzione / Aumento della TEMPERATURA Sensibilità cellulare STOCCAGGIO Mantenimento nel TEMPO Ripristino del MICROAMBIENTE Ripresa del METABOLISMO
Gardner et al. 2004 La crioconservazione riduzione delle attività enzimatiche modificazioni della conformazione della membrana cellulare RAFFREDDAMENTO riduzione dei meccanismi di trasporto attivo un progressivo aumento della solubilità dei gas con aumento delle pressioni parziali di CO 2, O 2, N 2.
La crioconservazione La curva di raffreddamento è specifica ed ottimale per ogni tipo di cellula. I fattori che devono essere tenuti presenti sono: Contenuto intracellulare di acqua Permeabilità della membrana Rapporto Superficie/Volume della cellula Gardner et al. 2004
Crioprotettori Si dividono in due categorie: Permeanti o Intracellulari: molecole che diffondono attraverso la membrana Non Permeanti o Extracellulari: molecole che producono una condizione di disidratazione cellulare abbassano il punto di congelamento della soluzione azione diretta sulla membrana cellulare modificano l ambiente intra ed extra cellulare sostituendosi all acqua e diminuendo la formazione di cristalli di ghiaccio Permeanti o Intracellulari: alcoli (PROH Etilen Glicole) o DMSO Non Permeanti o Extracellulari: disaccaridi CRIOPROTETTORI tempo di esposizione all agente chimico temperatura a cui avviene l esposizione Gardner et al. 2004
Tecniche di Crioconservazione È possibile crioconservare: Spermatozoi Tessuto testicolare Ovociti Tessuto ovarico Zigoti Embrioni Blastocisti Congelamento Lento Vitrificazione
Congelamento Lento Gli ovociti o gli embrioni trattati con il crioprotettore sono trasferiti in un congelatore biologico che gradualmente li porta dalla temperatura corporea di 37 C alla temperatura -40 C. Il seeding, formazione del primo nucleo di ghiaccio, si verifica tra -5 e -15 C Mentre la temperatura diminuisce si crea un gradiente osmotico per mezzo del quale l acqua si sposta dal citoplasma nell ambiente extra cellulare. 1. Bassi livelli di crioprotettori 2. Lento freezing rate 3. Lenta disidratazione della cellula per minimizzare la formazione di cristalli di ghiaccio CONGELAMENTO LENTO Controlled Freezing Rate
CONGELAMENTO LENTO Durata: 2 ore oppure cryotube paillettes can PLANER tank azoto liquido
Vitrificazione Ice Free Cryoconservation Il congelamento ultrarapido di una soluzione acquosa provoca un aumento della viscosità della soluzione ed il conseguente passaggio di fase da uno stato liquido ad uno stato vetroso senza formazione di cristalli di ghiaccio. Vitrification is a revolution Van der Elst, 2007 Rall & Fahy, 1985 «Crystallization is incompatible with living system and should be avoided whenever possible» Luyet, 1937 La vitrificazione è un valido protocollo alternativo al congelamento lento P. Vanderzwalmen, 2007
In laboratorio: la vitrificazione oggi Il protocollo migliore è il «Cryotop Method» Consente di velocizzare molto l intera procedura esponendo la cellula ad un contatto diretto con la soluzione per la vitrificazione per un periodo brevissimo. Le cellule vengono collocate su un supporto molto sottile, in modo da ridurre al minimo la quantità di crioprotettore. Successivamente gli ovociti vengono coperti da una capsula di plastica e immerse nell azoto liquido. 1. Elevati livelli di crioprottettori 2. Elevato cooling rate 3. Non si formano cristalli di ghiaccio
«Cryotop Method»
Vitrificazione Durata: circa 10 minuti paillettes tank azoto liquido
Vitrificazione 1. Elevati livelli di crioprotettori 2. Elevato cooling rate 3. Non si formano cristalli di ghiaccio Elevato cooling rate 15.000-30.000 C/min Elevate concentrazioni di crioprotettori = tossicità Contatto diretto con N 2 liquido = possibile contaminazione virale Punti critici della vitrificazione E. Van den Abbeel, 2007
Vitrificazione Vantaggi: È una procedura semplice Costi ridotti Facile addestramento dell operatore La percentuale di sopravvivenza è più alta in tutti gli stadi di sviluppo embrionale
La vitrificazione nella letteratura scientifica 140 120 100 80 60 40 20 0 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 R. Ciriminna, 2010
Congelamento lento: clinical outcome A. Borini, 2007
Vitrificazione: clinical outcome
Congelamento Lento VS Vitrificazione Danni intracellulari Congelamento Lento Perdita di microtubuli Vitrificazione Danneggiamento dei microtubuli Aneuploidie Aneuploidie
Congelamento Lento VS Vitrificazione Crioconservazione degli embrioni Sospensione delle attività biologiche -196 C Destino dell acqua cellulare Formazione di ghiaccio intracellulare Raffreddamento in equilibrio Raffreddamento non in equilibrio Congelamento Lento Vitrificazione E. Van den Abbeel, 2007
Nessuna differenza tra ovociti freschi e vitrificati? 600 pazienti riceventi 300 ovociti freschi 300 ovociti vitrificati Gravidanze evolutive 41,7% Gravidanze evolutive 43,7% Ana Cobo, 2010
Il gamete femminile Metafase II Elevato rapporto superficie/volume La sopravvivenza cellulare allo scongelamento e l assenza di degenerazione non sono sempre garanzia di funzionalità ed integrità dell ovocita
impatto sulla fisiologia dell ovocita Possibili danni alla cellula durante la crioconsevazione indurimento della zona pellucida permeabilità della membrana degenerazione del PB depolimerizzazione del fuso danni al citoscheletro e al citoplasma
Efficienza La crioconservazione degli ovociti è stata considerata una tecnica a bassa efficienza a causa della bassa sopravvivenza, fertilizzazione e capacità di divisione dell embrione. Il miglioramento dei protocolli di congelamento ha reso la tecnica più soddisfacente sopravvivenza degli ovociti allo scongelamento. Con l introduzione dell ICSI sono migliorati i risultati anche in termini di fecondazione, di formazione degli embrioni e di impianto.
Sopravvivenza ovocitaria Porcu et al., 2000 Fabbri et al., 2001 Fosas et al., 2003 Chen et al., Borini et al. 2005 sopravvivenza 54% sopravvivenza 82% sopravvivenza 89% sopravvivenza 75-80% La sopravvivenza deve coincidere con la conservazione dei fattori morfo-funzionali essenziali verificabili oggettivamente
Considerazioni Bambini sani, cromosomicamente normali, sono nati da ovociti congelati (300) Il congelamento degli ovociti dovrebbe esser considerata una tecnica di routine nei programmi di PMA La vitrificazione sembra essere una tecnica molto promettente (economica, semplice e di facile acquisizione) L efficienza clinica della vitrificazione dovrebbe essere misurata come percentuale di gravidanza, riproducibilità e gestibilità della tecnica L. De Santis, 2010
Ovocita Pronucleato - 2PN Vantaggi motivi etici e legali massimizzare le possibilità di gravidanza da un singolo ciclo di stimolazione unicellularità migliore resistenza, rispetto all ovocita, poiché i cromosomi non sono disposti in piastra metafasica ma sono protetti all interno di ciascun pronucleo maggiore tasso di sopravvivenza allo scongelamento basso impatto sulla competenza cellulare semplicità nel valutare il successo tramite il passaggio dalla singamia alla prima divisione G.M. Jones, 2009
Svantaggi Ovocita pronucleato - 2PN Crioconservazione di un gran numero di unità con un basso potenziale di sviluppo ; ma ciò può essere migliorato congelando solo ovociti fecondati con un buon PN score Ridotta possibilità di selezione morfologica cellulare embrionale Aumentare il numero di cicli prima di ottenere una gravidanza Ottima organizzazione del personale del IVF lab G.M. Jones, 2009
Timing del congelamento - 2PN La crioconservazione deve avvenire tra le 16-20h post-inseminazione, cioè durante la fase G2 del ciclo cellulare. Non è possibile congelare durante la singamia, cioè 23-26h post inseminazione, allo stadio di una cellula. G.M. Jones, 2009
Congelamento Lento VS Vitrificazione 2PN Pubblicazione Metodo N 2PN Sopravvivenza (%) Divisione (%) IR % cong. Hoover et al., 1997 C 761 718(94) 647 (85) 7 % Damario et al., 1999 C 724 657 (91) 650 (90) 20 % Kattera et al., 1999 C 701 452 (64) 369 (53) 5 % Senn et al., 2000 C 1000 804 (80) 750 (75) 11 % Selman et al., 2002 V 27 17 (67) 14 (52) 18 % Isachenko et al., 2003 V 59 42 (71) 35 (59) 15 % Veeck, 2004 C 1441 1101 (76) 997 (69) 17 % Al-Hasani et al., 2007 V 339 302 (89) 243 (72) 16 % C = Congelamento Lento; V = Vitrificazione
Fresh vs Frozen 2PN Pubblicazione N 2PN Frozen % Sopravvivenza % Divisione % IR Frozen % IR Fresh Fugger et al. 1988 82 93 % 76 % 5 % 3 % Miller et al. 1995 239 87 % 82 % 11 % 13 % Damario et al. 2000 398 91 % 90 % 22 % 25 %
Selezione ovocitaria per la crioconservazione embrionale Valutazione dell ovocita morfologia assetto nucleare Caratteristiche dell ovocita pronucleato / 2PN PN score K. Lundin, 2007
Selezione embrionale per la crioconservazione Clivaggio Early Cleavage 25-27h Numero di cellule 40-44 h Morfologia percentuale di frammenti dimensione dei blastomeri Numero di nuclei no MNB Stato Metabolico e Genetico PGD K. Lundin, 2007
Qualità cellulare Caratteristiche morfologiche, nucleari, metaboliche e genetiche dell embrione crioconservato Sviluppo embrionale Potenziale di impianto Bambini in braccio K. Lundin, 2007
Frozen Embryo Transfer (FET) VS Fresh Embryo Transfer (ET) L andamento delle gravidanze da FET è sovrapponibile alle gravidanze da ET Il tasso di gravidanze multiple è più basso per i FET Il principale fattore che influenza il successo dei FET è l età della paziente al momento del prelievo ovocitario Bassa incidenza di complicanze durante gravidanze singole sovrapponibile alle gravidanze con embrioni freschi ( placenta previa, rottura prematura delle membrane, morte endouterina) D. Royère, 2007
Frozen Embryo Transfer (FET) VS Fresh Embryo Transfer (ET) Il FET di embrioni di buona qualità, determina un notevole aumento del tasso di gravidanza cumulativo. Sebbene vi sia una diminuzione delle percentuali di gravidanza e dell I.R. nei FET, sintomo di qualità embrionale compromessa dal congelamento, il successo complessivo di transfer con embrione di buona qualità è paragonabile al ET D. Royère, 2007
Crioconservazione della blastocisti La blastocisti contiene un elevato numero di piccole cellule Selezione di embrioni al più alto potenziale di impianto Vantaggio criobiologico e citogenetico
Età 38 anni Trombofilia Partner normozoospermico Inseminati 7 ovociti Fertilizzati 5/7 Transfer DAY 3 Top Quality embryo Case report 2 embrioni residui crioconservati in DAY 5 Scongelati 6 mesi dopo 1 CG 1 BHF
Grazie per l attenzione! Sometimes nature needs a little help