ISTRUZIONI PER L USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI PER L USO Rev.: April 2013 BD BBL CHROMagar Salmonella Brevetto U.S.A. n. 5.098.832, 5.194.374 USO PREVISTO BBL CHROMagar Salmonella è un terreno selettivo e differenziale per l'isolamento e l'identificazione presuntiva di Salmonella spp. da campioni clinici di feci. BBL CHROMagar Salmonella è stato anche validato dall'aoac Research Institute nell'ambito del programma Performance Tested Methods soltanto per l'analisi di carne di manzo macinata cruda, pollo crudo, pesce crudo, lattuga e gusci d'uovo. ISO, USDA FSIS e FDA BAM. 1-3 BBL CHROMagar Salmonella è risultato equivalente ai terreni in piastra raccomandati nelle metodiche ISO, FDA e USDA. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodica microbiologica. La Salmonella è ubiquitaria nelle popolazioni animali e viene generalmente isolata dal tratto intestinale dell animale e dell uomo. È uno dei microrganismi a maggiore prevalenza come causa di malattia di origine alimentare, spesso di fonte animale. 4 Le malattie causate da Salmonella sono state associate a pollame, manzo, cioccolato, latticini e prodotti vegetali. 5 Il terreno BBL CHROMagar Salmonella è destinato all isolamento e alla differenziazione di Salmonella spp. L aggiunta di substrati cromogeni nel terreno facilita la rilevazione di Salmonella spp. rispetto ad altra flora batterica. BBL CHROMagar Salmonella è stato originariamente sviluppato da A. Rambach, CHROMagar, Parigi, Francia. BD, in conformità a un contratto di licenza, ha ottimizzato tale formulazione avvalendosi di proprietà intellettuale esclusiva usata nella produzione del terreno su piastra pronto per l uso BBL CHROMagar Salmonella, che utilizza la formulazione del terreno di coltura disidratato Difco CHROMagar Salmonella. In BD CHROMagar Salmonella i nutrienti sono forniti da peptoni appositamente selezionati. I microrganismi gram-positivi vengono generalmente inibiti dalla base del terreno selettivo. L aggiunta di un agente antifungino impedisce la crescita di Candida spp., mentre altri antibiotici vengono utilizzati per inibire la crescita di batteri gram-negativi non fermentanti il glucosio e Proteus spp., potenzialmente in grado di crescere più delle colonie di Salmonella. La miscela cromogena viene inclusa nel terreno. A causa delle differenze metaboliche dovute alla presenza di cromogeni selezionati, le colonie di Salmonella spp. assumono una colorazione malva (da rosa a porpora), mentre i batteri indesiderati vengono inibiti oppure sviluppano colonie di colore blu verde o incolori. *I CAMPIONI FORNITI DAL PRODUTTORE DI QUESTO MODELLO DI KIT PER TEST SONO STATI VALUTATI IN MODO INDIPENDENTE DALL AOAC RESEARCH INSTITUTE E SONO RISULTATI CONFORMI ALLE SPECIFICHE PRESTAZIONALI RIPORTATE NEL FOGLIETTO ILLUSTRATIVO ALLEGATO AL KIT. IL PRODUTTORE CERTIFICA CHE QUESTO KIT È CONFORME SOTTO TUTTI GLI ASPETTI ALLE SPECIFICHE ORIGINARIAMENTE VALUTATE DALL AOAC RESEARCH INSTITUTE, SECONDO QUANTO RIPORTATO NEL Performance Tested Methods - CERTIFICATO NUMERO 020502.
REAGENTI Formula** per litro di acqua purificata Cromopeptone 22,0 g Miscela cromogena 0,34 g Agenti inibitori 0,02 g Agar 15,0 g ph 7,7 ± 0,2 **Aggiustata e/o supplementata per soddisfare i criteri di rendimento. PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Se la piastra presenta un umidità eccessiva, capovolgere il fondo sul coperchio un po spostato e lasciare asciugare all aria per evitare la formazione di aderenze tra la parte superiore e inferiore della piastra durante l incubazione. Proteggere la piastra dalla luce mentre si asciuga. Vedere CONSERVAZIONE E VITA UTILE. Al fine di acquisire familiarità con le reazioni (cromatiche) cromogeniche attese sviluppate da Salmonella, si raccomanda all utente di inoculare i ceppi rappresentativi comunemente osservati nel suo istituto. Si suggeriscono i seguenti ceppi: Salmonella ser. Typhimurium, ATCC 14028; Salmonella ser. Dublin, ATCC 15480; Salmonella ser. Typhi, ATCC 19430 e Salmonella enterica ssp. arizonae, ATCC 12323. I campioni clinici possono contenere microrganismi patogeni, inclusi i virus dell'epatite e dell'immunodeficienza umana. Manipolare tutti i materiali e gli articoli contaminati con sangue e altri fluidi biologici in conformità alle norme dell'istituto e alle Precauzioni standard. 6-9 Per maggiori dettagli e per le procedure di manipolazione in asepsi, i rischi biologici e lo smaltimento di prodotti usati, consultare il documento ISTRUZIONI GENERALI PER L USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. Deterioramento del prodotto Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni di colore, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Verificare che le piastre non presentino segni di deterioramento come descritto in Deterioramento del prodotto. Controllare le prestazioni inoculando un campione rappresentativo di piastre con colture pure di microrganismi di controllo stabili che producono reazioni note e attese. Si raccomandano i seguenti ceppi di test: Ceppi Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Salmonella Enteritidis ATCC 13076 Citrobacter freundii ATCC 8090 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 Proteus mirabilis ATCC 43071 Risultati della crescita Crescita moderata intensa di colonie di leggero color malva (da rosa a porpora) Crescita; colonie color malva (da rosa a porpora) Crescita moderata intensa di colonie di colore bluverde, da leggero a intenso Inibizione da parziale a completa; colonie di colore blu-verde Inibizione parziale; colonie di colore blu-verde Inibizione da parziale a completa
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Aspetto del terreno non inoculato Inibizione da parziale a completa; piccole colonie di colore blu-verde Inibizione (da parziale a completa) Da incolore a leggermente ambra, trasparente N.B.: Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. PROCEDURA Materiali forniti BBL CHROMagar Salmonella (piastre Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate. Materiali necessari ma non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti, microrganismi per controllo di qualità e apparecchiature di laboratorio necessarie per la specifica procedura di laboratorio seguita, come per esempio ISO 7218, USDA FSIS MLG, FDA BAM o altra modalità specifica adottata. Raccolta dei campioni Per informazioni dettagliate sulle procedure di raccolta e trattamento dei campioni, consultare la documentazione appropriata. 1-5 Tipi di campioni Questo terreno può essere usato con campioni clinici di feci e svariati campioni alimentari (carne di manzo macinata cruda, pollo crudo, pesce crudo, lattuga e gusci d uovo). Procedura del test Adottare tecniche asettiche. La superficie agar deve essere omogenea e non eccessivamente umida. Prima dell inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura ambiente. Campioni clinici - Non appena perviene in laboratorio, inoculare il campione su una piastra BBL CHROMagar Salmonella e strisciare per l isolamento. Se il campione è posto in coltura da tampone, passare delicatamente il tampone su una piccola area della superficie in corrispondenza del bordo e strisciare da quest area con un'ansa. Le procedure di alcuni centri prevedono l inoculo obbligatorio di terreni aggiuntivi per l isolamento di Salmonella e per la rilevazione di altri agenti patogeni enterici. Incubare le piastre in aerobiosi a 35 ± 2 C, capovolte (lato agar rivolto verso l alto), per 24 h. Se dopo 24 h il risultato è negativo, incubare per altre 24 h allo scopo di refertare i risultati finali. Una volta che la colorazione delle colonie si sia sviluppata, è possibile esporre BBL CHROMagar Salmonella alla luce. Le colonie tipiche di Salmonella devono essere sottoposte a test di conferma biochimici o sierologici. BD CHROMagar Salmonella può inoltre essere utilizzato come terreno di subcoltura da brodi di prearricchimento, come per esempio brodo selenite o brodo tetrationato. Campioni alimentari: Seguire il metodo di preparazione dei campioni illustrato nel Microbiology Laboratory Guidebook USDA FSIS. Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, and Egg Products, capitolo dell FDA BAM sulla Salmonella, nelle linee guida ISO oppure nelle linee guida procedurali appropriate per il tipo di campione e la località geografica. Inoculare il campione in brodo di arricchimento incubato su una piastra BBL CHROMagar Salmonella. Strisciare per l isolamento, incubare le piastre in aerobiosi a 35 ± 2 C, capovolte (lato agar rivolto verso l alto), per 24 h. Se dopo 24 h il risultato è negativo, incubare per altre 24 h allo scopo di refertare i risultati finali. Le colonie tipiche di Salmonella che crescono sul terreno BBL CHROMagar Salmonella devono essere sottoposte a test di conferma come illustrato nelle procedure ISO, USDA FSIS e FDA BAM. 1-3 Risultati Dopo un incubazione appropriata, leggere le piastre su uno sfondo bianco. Salmonella Typhimurium e altre Salmonella spp. appariranno come colonie di color malva, da leggero a intenso, a eccezione di Salmonella enterica ssp. arizonae e altre Salmonella spp. positive per lattosio e beta-glucosidasi, i cui isolati appariranno come colonie di colore blu-violetto o porpora. Citrobacter e altri coliformi appariranno come colonie di colore blu-verde, da leggero a intenso.
Alcuni microrganismi che non idrolizzano alcun composto cromogeno possono apparire come colonie incolori. CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA BBL CHROMagar Salmonella è un terreno selettivo e differenziale per l isolamento e l identificazione presuntiva di Salmonella spp. da campioni clinici di feci e svariati campioni alimentari. Risultati attesi Su questo terreno, le colonie di Salmonella spp. appariranno di color malva, da leggero a intenso (ossia da rosa a porpora), a eccezione di Salmonella spp. positive per lattosio e betaglucosidasi, i cui isolati appariranno come colonie di colore blu-violetto o porpora. Nel corso di valutazioni interne ed esterne di campioni clinici ed industriali, sulle piastre BBL CHROMagar Salmonella sono stati isolati i seguenti microrganismi: Salmonella 8, (20):-:26 Salmonella ser. Javiana Salmonella enterica ssp. arizonae Salmonella ser. Johannesburg Salmonella enterica ssp. diarizonae Salmonella ser. Kentucky Salmonella ser. Abony Salmonella ser. London Salmonella ser. Adelaide Salmonella ser. Mbandaka Salmonella ser. Agona Salmonella ser. Michigan Salmonella ser. Anatum Salmonella ser. Minnesota Salmonella ser. Bareilly Salmonella ser. Montevideo Salmonella ser. Berta Salmonella ser. Muenster Salmonella ser. Brandenburg Salmonella ser. Newport Salmonella ser. California Salmonella ser. Oranienburg Salmonella ser. Cerro Salmonella ser. Panama Salmonella ser. Choleraesuis Salmonella ser. Paratyphi A Salmonella ser. Cubana Salmonella ser. Paratyphi B Salmonella ser. Derby Salmonella ser. Pomona Salmonella ser. DT 104 Salmonella ser. Poona Salmonella ser. Dublin Salmonella ser. Potsdam Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser. Pullorum Salmonella ser. Essen Salmonella ser. Rubislaw Salmonella ser. Gallinarum Salmonella ser. Schwarzengrund Salmonella ser. Gaminara Salmonella ser. Senftenberg Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. St. Paul Salmonella ser. Hartford Salmonella ser. Thompson Salmonella ser. Heidelberg Salmonella ser. Typhi Salmonella ser. Illinois Salmonella ser. Typhimurium Salmonella ser. Infantis Salmonellaser. Typhimurium (lattosio-positiva) Salmonella ser. Iverness Salmonella ser. Weltevreden Caratteristiche prestazionali 10 Test clinici BBL CHROMagar Salmonella è stato testato in un grande laboratorio diagnostico. 150 campioni di feci di negatività accertata e 110 di positività accertata sono stati complessivamente testati sul terreno BBL CHROMagar Salmonella e comparati alle prestazioni dei terreni XLD ed Hektoen Enteric. La sensibilità e la specificità del terreno BBL CHROMagar Salmonella dopo 18-24 h di incubazione sono rispettivamente risultate del 76% e 99% a fronte del 90% e 94% dopo 48 h di incubazione. La sensibilità e la specificità sono rispettivamente salite al 99% e 97%, in caso di subcultura da brodo Selenite F. I risultati comparativi di sensibilità e specificità per il terreno XLD sono stati 71% e 97% dopo 18-24 h di incubazione rispetto a 78% e 95% dopo 48 h di incubazione; i risultati di sensibilità e specificità per il terreno Hektoen Enteric sono stati 71% e 94% dopo 18-24 h e 79% e 93% dopo 48 h di incubazione.
Test agroalimentari Metodiche USDA e FDA BBL CHROMagar Salmonella è stato valutato per il recupero di Salmonella in pollo crudo, carne di manzo macinata cruda, pesce crudo, lattuga e gusci d uovo in laboratori interni ed esterni approvati dall AOAC. Il pollo crudo e il manzo macinato sono stati trattati in conformità alle metodiche di riferimento USDA FSIS. Il pesce crudo, la lattuga e i gusci d uovo sono stati invece trattati secondo le procedure FDA BAM. Il recupero selettivo di Salmonella nel terreno BBL CHROMagar Salmonella è stato comparato a quello nei terreni delle metodiche di riferimento. Dal pollo crudo sono state complessivamente ottenute 16 colture positive, 17 dalla carne di manzo macinata cruda, 18 dal pesce crudo e dalla lattuga e 11 dai campioni di gusci d uovo. Il terreno BBL CHROMagar Salmonella ha raggiunto risultati comparabili alle metodiche di riferimento su tutte le matrici, raggiungendo una concordanza di metodica del 100%. Venti campioni di pollo crudo addizionati sono stati testati in conformità alle metodiche di riferimento USDA FSIS. Nel pollo è stato seminato un inoculo di campione a bassa concentrazione, pari a 8 UFC/25 g e uno ad alta concentrazione, pari a 50 UFC/25 g. BBL CHROMagar Salmonella ha recuperato il 100% (20/20) degli inoculi di Salmonella, sia ad alta che a bassa concentrazione. A concentrazioni di inoculo inferiori a CFU/25 g, è stato ottenuto un recupero esiguo. Sono stati testati campioni di pollo contaminati in modo naturale. Il recupero di Salmonella è stato pari al 100% e il numero più probabile (MPN)/g è stato dello 0,23. Centodiciotto (118) isolati di Salmonella di origine alimentare, comprendenti vari sierotipi, sono stati posti in coltura in brodo lattosio per 24 h e quindi in subcultura in brodo tetrationato per altre 24 h. I brodi tetrationato sono stati posti in subcultura nel terreno BBL CHROMagar Salmonella e incubati a 35 C. Le piastre in cui dopo 24 h non erano state recuperate colonie color malva, sono state incubate per altre 24 h. BBL CHROMagar Salmonella ha recuperato 111 isolati. Quattro ceppi sono stati inibiti dal brodo tetrationato e non sono stati recuperati su BBL CHROMagar Salmonella né su una piastra di controllo non selettivo. Altri isolati con sierotipi identici ai quattro negativi hanno in effetti generato colonie tipiche e pertanto la mancanza di reazione positiva è stata specifica per ceppo, non per sierotipo. La sensibilità complessiva di CHROMagar Salmonella è stata del 94% (111 isolati su 118). Sessantacinque (65) isolati di non-salmonella sono stati posti in coltura in brodo di infuso cuore-cervello a 35 C per 24 h e quindi in subcultura nel terreno BBL CHROMagar Salmonella a 35 C per altre 24 h. Le piastre negative sono state complessivamente incubate per 48 h. Sessantuno (61) isolati su 65 non hanno sviluppato colorazione malva su BBL CHROMagar Salmonella fornendo così una specificità del 94%. I quattro ceppi non- Salmonella che hanno sviluppato colorazione malva sono stati inoculati in brodo tetrationato (brodo di arricchimento raccomandato per le metodiche USDA e FDA). Dopo 24 h di incubazione, i brodi tetrationato sono stati posti in subcultura nel terreno BBL CHROMagar Salmonella. Dopo 48 h di incubazione, un ceppo ha sviluppato colonie color malva e tre ceppi sono stati inibiti. In base all uso dell arricchimento con brodo tetrationato, la specificità complessiva di BBL CHROMagar Salmonella in questo studio è stata del 98%. MetodIca ISO Il recupero selettivo di Salmonella in pollo crudo, carne di manzo macinata cruda, pesce crudo, lattuga e gusci d uovo, nel terreno BBL CHROMagar Salmonella è stato comparato a quello nei terreni delle metodiche di riferimento. Tutte le matrici sono state trattate in conformità alla metodica di coltura ISO. Dal pollo crudo sono state complessivamente ottenute 16 colture positive, 17 dalla carne di manzo macinata cruda, 9 dal pesce crudo, 19 dalla lattuga e dai campioni di gusci d uovo. Il terreno BBL CHROMagar Salmonella ha raggiunto risultati comparabili alle metodiche di riferimento su tutte le matrici, raggiungendo una concordanza di metodica del 100%.
Venti (20) campioni di carne di manzo macinata cruda, pesce crudo, lattuga e gusci d uovo sono stati addizionati con un inoculo a bassa concentrazione di Salmonella e analizzati in conformità alla procedura di coltura ISO. Venti (20) campioni di pollo crudo contaminato in modo naturale sono stati testati secondo la procedura di coltura ISO. BBL CHROMagar Salmonella è stato aggiunto alla batteria di terreni di riferimento per ogni matrice alimentare testata. La concordanza di metodica del terreno BBL CHROMagar Salmonella e degli altri terreni di riferimento testati è stata del 100%. Il range delle basse concentrazioni di inoculo è stato 0,0036 0,23 MPN/g. Centoventisette (127) isolati di Salmonella di origine alimentare sono stati posti in coltura in acqua peptonata tamponata per 18 h e quindi in subcultura in terreno Rappaport-Vassiliades con soia (RVS) per altre 24 h. I brodi RVS sono stati posti in subcultura in BBL CHROMagar Salmonella e incubati a 35 C per 24 h. Le piastre in cui dopo 24 h non erano state recuperate colonie color malva, sono state incubate per altre 24 h. BBL CHROMagar Salmonella ha recuperato 123 isolati. Il recupero di 4 ceppi non cresciuti nel terreno BBL CHROMagar Salmonella è stato mediocre nei terreni di controllo non selettivo. La sensibilità complessiva di CHROMagar Salmonella è stata del 96,8% (123 isolati su 127). Limitazioni della procedura Occasionalmente è possibile che ceppi di Aeromonas hydrophila, Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinobacter spp. o Candida spp. non vengano completamente inibiti e le colonie sviluppino una pigmentazione di color malva, da leggero a intenso. I test di conferma che utilizzano lo sviluppo di color malva o porpora come indicatore di reazione possono essere difficili da interpretare a causa del colore effettivo delle colonie. Su questo terreno, è possibile che rari ceppi di S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Minnesota, S. enterica ssp. arizonae e S. Pullorum non crescano o presentino una crescita ridotta. Si tratta di un evento specifico per ceppo e la maggior parte dei ceppi testati di ciascuna di queste sierovarianti è stata recuperata. BD CHROMagar Salmonella non è destinato all'isolamento di patogeni intestinali all infuori di Salmonella. Durante il test di alcuni campioni, è possibile osservare una decolorazione porpora del terreno, in assenza di una crescita di colonie rilevabile. Tale risultato deve essere considerato negativo. Ridurre al minimo l'esposizione di BBL CHROMagar Salmonella alla luce prima e durante l'incubazione, in quanto la luce può distruggere i cromogeni. Conservare le piastre all interno della scatola di cartone e della confezione originaria per tutto il periodo di conservazione. Si sconsiglia l incubazione in CO 2. BIBLIOGRAFIA 1. Rose, Bonnie E. 2001. Isolation and identification of Salmonella from meat, poultry and egg products. In: Microbiology laboratory guidebook, 3 rd ed., Food Safety and Inspection Service, U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C. 2. U.S. Food and Drug Administration. 2003. Bacteriological analytical manual (online), AOAC International, Gaithersburg, MD. 3. International Organization for Standards (ISO). Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp., 4 th Edition, ISO 6579:2002. 4. Bopp, Brenner, Fields, Wells and Strockbine. 2003. Escherichia, Shigella, and Salmonella. In Murray, Baron, Jorgensen, Pfaller, and Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5. D Aoust, Mauer and Bailey. 2001. Salmonella species. In: Doyle, Beuchat and Montville (ed.), Food microbiology: fundamentals and frontiers, 2 nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2 nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
7. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 8. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4 th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 9. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 10. Dati archiviati presso BD Diagnostic Systems. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BBL CHROMagar Salmonella REF 254104 Terreni su piastra pronti per l'uso, confezioni da 20 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ AOAC is a trademark and Performance Tested is a service mark of AOAC International. CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. Difco is a trademark of Difco Laboratories, subsidiary of Becton, Dickinson and Company. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD