BD CHROMagar Orientation Medium

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1 PA ISTRUZIONI PER L'USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI ALL'USO PA Rev.: Sep 2011 BD CHROMagar Orientation Medium USO PREVISTO BD CHROMagar Orientation Medium (terreno di coltura di orientamento BD CHROMagar) è un terreno di coltura non selettivo per l'isolamento, l'identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni del tratto urinario. BD CHROMagar Orientation Medium consente di differenziare e identificare l'escherichia coli e l'enterococco senza test di conferma. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. I gruppi di Escherichia coli, enterococchi, Klebsiella-Enterobacter-Serratia e Proteus-Morganella- Providencia sono gli organismi che più frequentemente causano infezioni del tratto urinario. Il 60-70% delle infezioni urinarie sono causate da E. coli in coltura pura o unitamente ad enterococchi. Lo Staphylococcus saprophyticus e lo Streptococcus agalactiae si riscontrano, anche se con minor frequenza, nelle infezioni del tratto urinario di pazienti donne. Data la diversa sensibilità antimicrobica degli agenti patogeni, per instaurare una terapia efficace è necessario procedere all'identificazione delle specie con batterie di test biochimici. Si tratta di una delle attività che richiedono più tempo per i laboratori che trattano campioni di urine. Le specie o gruppi di organismi isolati con maggiore frequenza producono enzimi caratteristici. Pertanto è possibile identificare tali organismi a livello di specie, con un numero limitato di test di utilizzo o fermentazione del substrato. 1,2 Alcuni degli organismi in questione producono enzimi per il metabolismo del lattosio o glucosidi, oppure entrambi, mentre altri non producono nessuno di questi enzimi. Ad esempio, l'e. coli produce enzimi del metabolismo del lattosio ma è negativa per quanto riguarda la ß-glucosidasi. Altri membri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono positivi alla ß-glucosidasi ma non contengono gli enzimi necessari per la fermentazione del lattosio, mentre altri possono contenere entrambi i tipi di enzimi o nessuno di essi. Le beta-glucosidasi si trovano anche nei cocchi Gram-positivi ad esempio enterococco spp. e Streptococcus agalactiae. La triptofano deaminasi (TDA) è un enzima che di solito si trova negli organismi del gruppo Proteus- Morganella-Providencia. Dalle valutazioni delle prestazioni è emerso che BD CHROMagar Orientation Medium è migliore dei terreni di coltura differenziali, come l'agar CLED o una combinazione degli agar Blood e MacConkey, comunemente utilizzati per l'isolamento, la differenziazione e la conta degli agenti patogeni che causano infezioni del tratto urinario. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium consente l'identificazione dell'e. coli e degli enterococchi direttamente sulla piastra di isolamento; inoltre permette di identificare in via presuntiva gran parte dei ceppi di Staphylococcus saprophyticus e S. agalactiae, oltre che i gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (=KES) e Proteus-Morganella-Providencia (=PMP) per mezzo della colorazione della colonia e del terreno di coltura. Dato che BD CHROMagar Orientation Medium non è selettivo, può verificarsi la crescita di altri agenti patogeni del tratto urinario, ma sono necessari test biochimici per identificarli. CHROMagar Orientation Medium è stato sviluppato da A. Rambach e viene venduto da BD Diagnostic Systems su licenza di CHROMagar, Parigi, Francia. In BD CHROMagar Candida Medium i nutrienti sono forniti da peptoni appositamente selezionati. La miscela cromogena è costituita da substrati artificiali (cromogeni) che rilasciano composti di colore diverso a seconda della degradazione di enzimi microbici specifici, assicurando in tal modo la differenziazione diretta di alcune specie o la rilevazione di determinati gruppi di organismi, mediante semplici test di conferma.

2 REAGENTI BD CHROMagar Orientation Medium Formula* per litro di acqua purificata Cromopeptone 16,1 g Miscela cromogena 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 ± 0,2 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento. PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni cromatiche, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per informazioni più dettagliate, v. ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare le piastre in posizione invertita a C in aerobiosi per h. Ceppi Risultati della crescita Escherichia coli Crescita da buona a eccellente, colonie medio-grandi, dal rosa ATCC scuro al rosa acceso, trasparenti Enterobacter cloacae Crescita da buona a eccellente, colonie medie, blu scuro con ATCC Proteus mirabilis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Streptococcus agalactiae ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus saprophyticus ATCC (=NCTC 10516) Non inoculate o senza aloni violetti Crescita da buona a eccellente; colonie medie, dal bianco al beige, circondante da un alone ambra-marrone; nelle zone caratterizzate da densa crescita, il terreno di coltura può presentarsi completamente da ambra a marrone. La sciamatura è da parzialmente a completamente inibita. Crescita da buona a eccellente, piccole colonie dal verdazzurro al blu Crescita da discreta a buona; le colonie tendono ad essere piccole, dal verdazzurro chiaro all'azzurro, con o senza aloni Crescita da buona a eccellente, colonie medio-piccole, del loro colore naturale (bianco o panna) Crescita da discreta a buona; colonie piccole, opache, rosa chiaro-rosa Da incolori ad ambra molto chiaro, trasparenti PROCEDURA Materiali forniti BD CHROMagar Orientation Medium (piastre impilate Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate. Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. PA

3 Tipi di campioni Il terreno è utilizzato esclusivamente per la conta e la differenziazione dei batteri nelle urine. Si può utilizzare l'urina della minzione o del catetere, o quella raccolta mediante puntura vescicale ipogastrica (v. anche PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). Osservare le tecniche asettiche per il prelievo dei campioni urinari. Strisciare l'urina direttamente sul terreno non più tardi di 2 h dopo il prelievo o conservarla in frigorifero (non oltre 24 h) per evitare l'eccessiva crescita di agenti infettivi o contaminanti prima dell'inoculazione del terreno. Procedura del test È obbligatorio l'uso di anse calibrate o altre tecniche comunemente utilizzate per il posizionamento sulla piastra dei campioni di urina al fine di ottenere colonie isolate, con le tipiche forme e colori. Prelevare un campione di urina ben miscelata e non diluita usando un'ansa calibrata (0,01 o 0,001 ml). Verificare che l'ansa sia caricata correttamente con il campione. Inoculare il campione a metà della piastra con una sola strisciata da cui espandere ulteriormente l'inoculo. 6,7 Incubare le piastre in posizione invertita a C in aerobiosi per h. Evitare l'esposizione alla luce durante l'incubazione, in quanto la luce distrugge i cromogeni. Una volta che i colori delle colonie si sono sviluppati l'esposizione alla luce è consentita. Risultati Dopo l'incubazione le piastre dovrebbero presentare colonie isolate nelle aree in cui l'inoculo è stato correttamente diluito. Per l'identificazione o la differenziazione utilizzare la Tabella 1 e lo Schema 1 oppure servirsene come linee guida per ulteriori test di conferma. Per la verifica dei risultati possono essere utilizzati una colorazione di Gram o l'indagine microscopica. Tabella 1 Linee guida per l'identificazione in base ai diversi colori delle colonie Organismo Aspetto in BD CHROMagar Orientation Medium E. coli a Colonie medio-grandi, dal rosa scuro al rosa acceso, trasparenti, con o senza aloni sul terreno circostante Gruppo KES b Colonie medie, dall'azzurro al blu scuro, con o senza aloni violetti Gruppo PMP c Colonie dal bianco al beige circondate da aloni marroni d Enterococco Piccole colonie verdazzurre S. agalactiae Le colonie tendono ad essere piccole, dal verdazzurro chiaro al blu, con o senza aloni S. saprophyticus (la maggior Piccole colonie opache dal rosa parte dei ceppi) chiaro al rosa acceso, con o senza PA Test di conferma (Necessari per un'ulteriore differenziazione) BBL CRYSTAL E/NF per la differenziazione all'interno dei generi Indolo, H 2 S e, ODC f, BBL CRYSTAL E/NF per la differenziazione all'interno dei generi PYR g Disco alla novobiocina da 5 µg h aloni Altro (compresi i lieviti) Pigmentazione naturale (panna) Test di identificazione biochimici o sierologici adatti Per le note a piè di pagina a-h, vedere lo schema 1 Test di conferma Eseguire i test di conferma come richiesto (Tabella 1, Schema 1). Non applicare reagenti di rilevazione direttamente sulle colonie in BD CHROMagar Orientation Medium. I test devono invece essere eseguiti su filtri di carta con crescita proveniente dalle rispettive colonie. Per le colonie di E. coli di colore dal rosa scuro al rosa acceso, ma tendenti ad essere di piccole dimensioni, non utilizzare il reagente Kovac per l'indolo, in quanto il colore di queste colonie può interferire con il colore rosso indice di positività dei test per l'indolo; utilizzare in sostituzione reagente per l'indolo alla dimetilaminocinnamaldeide (DMACA) (verde = positivo).

4 Se si utilizzano altri test di conferma o sistemi di identificazione biochimici, seguire le relative istruzioni accompagnatorie. Eseguire un test di conferma per l'enterococco solo se è necessario risalire alla specie oltre il livello del genere. Schema 1: linee guida per le prestazioni dei test di identificazione su organismi selezionati Aspetto della colonia Piccola, rosa, opaca Colonie da incolori a beige, terreno da arancione a marrone Disco alla novobiocina da 5 µg Gruppo PMP sensibile resistente Test dell'indolo alla DMACA i PA S. intermedius, S. simulans S. saprophyticus, S. xylosus verde (positivo) H 2 S positivo e H 2 S negativo e Da incolore a rosa (negativo) ODC positivo f ODC negativo f BBL CRYSTAL GP per la differenziazione all'interno dei generi P. vulgaris Providencia spp., Morganella spp. P. mirabilis P. penneri a Vedere Limitazioni della procedura b KES = gruppo Klebsiella-Enterobacter-Serratia c PMP = gruppo Proteus-Morganella-Providencia d Il colore dall'ambra al marrone è dovuto alla positività alla triptofano deaminasi (TDA) comune a tutti gli organismi che fanno parte del gruppo PMP. Circa il 50% dei ceppi di P. vulgaris producono colonie blu su terreno da ambra a marrone. e Test convenzionale per l'acido solfidrico. f Test convenzionale per la ornitina decarbossilasi. g Test del piroglutamato per la pirrolidonil arilamidasi. h Inoculare per strisciamento una piastra Mueller Hinton II Agar con l'isolato. Posizionare un disco alla novobiocina (da 5 µg) sulla piastra inoculata. Incubare per h a C e determinare le dimensioni della zona di inibizione. (resistente: 16 mm, suscettibile: > 16 mm). i DMACA= Reagente alla dimetilaminocinnamaldeide per la produzione di indolo. Applicare il reagente su filtro di carta e strofinare una colonia con l'area contenente il reagente sul filtro di carta. Attendere sec. Il colore verde è indice della produzione di indolo (rosso o incolore = negativo). Calcolo e interpretazione dei risultati 6,7 Contare il numero di colonie (UFC) sulla piastra. Se è stata usata un'ansa da 0,01 ml, ogni colonia rappresenta 100 UFC/mL; se è stata usata un'ansa da 0,001 ml, ogni colonia corrisponde a 1000 UFC/mL di urina. 7 Urina della minzione e del catetere: le direttive vigenti stabiliscono che se un singolo isolato ha una densità di 10 5 UFC/mL è presente infezione, se la densità è <10 5 UFC/mL si ha contaminazione uretrale o vaginale, mentre una densità tra 10 4 e 10 5 UFC/mL rende necessario un riesame alla luce dei dati clinici. 7 I batteri contaminanti in genere appaiono in numero ridotto e in colonie di differenti forme. Urina prelevata mediante puntura vescicale ipogastrica: poiché la vescica è sterile nei soggetti non infetti, le UFC eventualmente osservate indicano la presenza di un'infezione. Gli agenti patogeni del tratto urinario di solito danno luogo a conte elevate, con colore e morfologia delle colonie uniformi in questo terreno di coltura. PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA BD CHROMagar Orientation Medium è un terreno di coltura cromogeno per l'identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni comuni del tratto urinario. Il terreno di

5 coltura è usato per l'isolamento di numerosi microrganismi a crescita aerobica, ad es. Enterobacteriaceae, Pseudomonas e altri bacilli Gram-negativi non fermentanti, enterococchi, stafilococchi e molti altri presenti nei campioni urinari. Dalle valutazioni delle prestazioni è emerso che BD CHROMagar Orientation Medium presenta vantaggi rispetto ad altri terreni di coltura utilizzati per l'isolamento, la differenziazione e la conta degli agenti patogeni del tratto urinario, quali l'agar CLED o una combinazione di agar Blood e MacConkey. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium consente la differenziazione e l'identificazione della E. coli e degli enterococchi senza test di conferma, in base ai criteri di identificazione stabiliti dallo standard M35-A dell'clsi Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline (Linee guida approvate per l'identificazione abbreviata di batteri e lieviti). 8 L'identificazione presuntiva di S. saprophyticus, S. agalactiae e dei gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) e Proteus-Morganella-Providencia (PMP) è possibile mediante la morfologia della colonia, la pigmentazione e l'alterazione cromatica del terreno di coltura. Dato che la maggior parte delle infezioni del tratto urinario sono causate da E. coli e/o enterococchi, l'uso di questo terreno di coltura riduce significativamente il carico di lavoro e il tempo necessari per inoculare e leggere i sistemi di identificazione necessari quando si utilizzano terreni di coltura convenzionali. Risultati delle prestazioni 4,9,10 Le prestazioni microbiologiche di BD CHROMagar Orientation Medium e di un terreno di coltura cromogeno antagonista sono state confrontate con quelle dell'agar Columbia con il 5% di sangue di montone e dell'agar MacConkey senza cristalvioletto per la conta e l'identificazione presuntiva di batteri responsabili di infezioni del tratto urinario. 4 Su un totale di 658 campioni clinici di urina, 118 non hanno mostrato alcuna crescita, 402 campioni hanno evidenziato una crescita con conta cellulare 10 5 UFC/mL e 138 campioni hanno mostrato una crescita con conte cellulari <10 5 UFC/mL. Dei campioni con conta cellulare 10 5 UFC/mL, 163 si sono dimostrati colture pure e 239 colture miste. È stato ottenuto un totale di 266 isolati di Escherichia coli su entrambi i terreni di coltura cromogeni, 260 sono stati isolati sull'agar contenente sangue e 248 sull'agar MacConkey. Uno dei ceppi (0,4%) non ha sviluppato il colore rosa acceso previsto su BD CHROMagar Orientation Medium e 23 ceppi (8,7%) non hanno sviluppato il colore rosa acceso previsto sul terreno di coltura antagonista. Gli enterococchi (BD CHROMagar Orientation Medium, n = 266; terreno di coltura antagonista, n = 265) hanno prodotto piccole colonie di colore verdazzurro su entrambi i terreni cromogeni. Cinquanta delle colture miste contenevano enterococchi che sono stati rilevati solo sui terreni cromogeni. È stato possibile identificare i gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) e Proteus-Morganella- Providencia (PMP) su entrambi i terreni cromogeni. Dei 66 isolati del gruppo KES, 63 hanno presentato una crescita del colore previsto su BD CHROMagar Orientation Medium e 58 dei 64 isolati hanno presentato una crescita del colore previsto sul terreno antagonista. Per gli altri microorganismi sono stati necessari ulteriori test di identificazione. In una seconda valutazione delle prestazioni condotta su un totale di 421 campioni clinici di urina, 286 hanno evidenziato la crescita di batteri o lieviti, BD CHROMagar Orientation Medium è stato confrontato con BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood. 9 Sul terreno cromogeno sono stati ottenuti 483 isolati e sul terreno dell'agar contenente sangue sono stati isolati 447 ceppi. I ceppi sono stati identificati biochimicamente. Dei ceppi di E. coli, il 95% è stato identificato correttamente in base al colore dal rosa chiaro al rosa acceso delle colonie, mentre il resto dei ceppi di E. coli non era pigmentato. Tutti gli isolati di Enterococcus spp. hanno mostrato il tipico colore azzurro-verdazzurro delle colonie. Gli isolati di Streptococcus agalactiae hanno dato luogo a piccole colonie dall'azzurro al verdazzurro e sono stati differenziati dagli enterococchi mediante la negatività al test PYR. Tutti gli isolati di Staphylococcus saprophyticus e S. simulans hanno prodotto piccole colonie rosa opache e sono stati differenziati con il test alla novobiocina e identificati a livello delle specie con test biochimici. In uno studio interno, condotto in cieco, che ha compreso l'analisi di oltre 900 ceppi batterici sviluppatisi nelle urine, la sensibilità e la specificità di identificazione di BD CHROMagar Orientation Medium per l'e. coli, esclusivamente in base al colore e alla morfologia della PA

6 colonia, è stata rispettivamente del 97% e 99%; per l'enterococco la sensibilità e la specificità di identificazione sono state rispettivamente del 99% e del 97%, (vedere la tabella). 10 Organismo Sensibilità % (Intervallo di attendibilità 95%) E. coli 277/286 96,9% (94,1 98,6%) Enterococco 319/324 98,5% (96,4 99,5%) Specificità % (Intervallo di attendibilità 95%) 638/645 98,9% (97,8 99,6%) 603/622 97% (95,3 98,2%) Limitazioni della procedura Dato che questo terreno di coltura non è selettivo, la crescita riguarderà anche altri agenti patogeni del tratto urinario. Le colonie che si presentano del loro colore naturale e non reagiscono con i substrati cromogeni su BD CHROMagar Orientation Medium devono essere ulteriormente differenziate con test biochimici o sierologici adeguati. Consultare la bibliografia. 1,2 Per le colonie di E. coli di colore dal rosa scuro al rosa accesso ma tendenti ad essere di dimensioni piccole, sono necessari altri test di conferma quali il test dell'indolo in diversi punti (reagente per l'indolo alla DMACA). I bacilli Gram-negativi diversi da quelli appartenenti al gruppo KES possono dare luogo a grandi colonie di colore blu su BD CHROMagar Orientation Medium e quindi per la loro identificazione potrebbero essere necessari ulteriori test biochimici. 11 In casi molto rari nell'urina potrebbero essere presenti Listeria monocytogenes o altre specie di Listeria (ad es., in conseguenza di aborto dovuto a questi agenti). La Listeria produce piccole colonie dal blu al verdazzurro PYR-negative, somiglianti allo Streptococcus agalactiae. Pertanto potrebbe essere utile preparare una colorazione di Gram di tutti i ceppi che, su questo terreno di coltura, danno luogo a piccole colonie di colore dal blu al verdazzurro PYR-negative. La presenza di bacilli Grampositivi può essere indice di Listeria, ma sono necessari ulteriori test biochimici per confermarne l'identificazione. Molto raramente, gli isolati di Aeromonas hydrophila possono produrre colonie dal rosa al rosa acceso. È possibile differenziarle dall'e. coli mediante un test per l'ossidasi (Aeromonas = positivo; E. coli = negativo). Occasionalmente, gli stafilococchi coagulasi-negativi diversi dallo S. saprophyticus, ad es., S. simulans, S. xylosus e S. intermedius, producono piccole colonie rosa opache. È pertanto necessario eseguire ulteriori test (vedere lo Schema 1) su questi isolati. BD CHROMagar Orientation Medium non supporta la crescita di organismi esigenti, quali la Neisseria, l'haemophilus o Mycoplasma spp. L'uso di questo terreno di coltura per campioni clinici e non clinici diversi dall'urina non è stato documentato. Prima di utilizzare per la prima volta BD CHROMagar Orientation Medium, si consiglia di far pratica con l'aspetto di una colonia tipica utilizzando ceppi definiti, ad es. i ceppi citati in CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE. BIBLIOGRAFIA 1. Isenberg, H.D. (ed.) Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, DC. 2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10 th ed. Mosby, Inc., St. Louis. PA

7 3. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved Guideline M35. Abbreviated identification of bacteria and yeast, CLSI, Wayne, PA.Search for latest version at 9. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 10. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 11. Abbott, S.L Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BD CHROMagar Orientation Medium N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: [email protected] CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD PA