PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA

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1 PA ISTRUZIONI PER L'USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI ALL'USO PA Rev.: April 2013 Glucose Agar Chloramphenicol Gentamicin and Chloramphenicol Penicillin and Streptomycin USO PREVISTO Glucose Agar è usato per l'isolamento e la coltura di funghi (lieviti, muffe e dermatofiti) da campioni clinici. Chloramphenicol, Gentamicin and Chloramphenicol e Penicillin and Streptomycin sono terreni selettivi per l'isolamento di funghi da campioni clinici. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. L'agar Sabouraud con glucosio è un terreno generico originariamente allestito per la coltura di dermatofiti. 1,2 Il terreno viene attualmente usato per l'isolamento e la coltura di tutti i funghi. 3-5 Nell'agar Sabouraud con glucosio, i fattori di crescita azotati sono forniti da peptoni, mentre il glucosio costituisce una fonte energetica per la crescita di microrganismi. Questa alta concentrazione di glucosio rappresenta un vantaggio per la crescita dei funghi (osmoticamente stabili), mentre gran parte dei batteri non tollera una elevata concentrazione di zuccheri. Il ph basso, inoltre, è ottimale per i funghi ma non per numerosi batteri: 3 L'agar Sabouraud con glucosio, infatti, è solo lievemente selettivo per i batteri. Chloramphenicol, Gentamicin and Chloramphenicol e Penicillin and Streptomycin sono terreni selettivi basati sull'agar Sabouraud con glucosio. Per inibire i batteri, sono stati aggiunti alcuni agenti selettivi. Il cloramfenicolo è un antibiotico ad ampio spettro che inibisce un'ampia gamma di batteri Gram-negativi e Gram-positivi ma può avere effetto inibente anche su numerosi funghi patogeni. 4 Antibiotici come penicillina, gentamicina e streptomicina, o una combinazione di tali agenti, sono in grado di inibire efficacemente i batteri senza incidere sulla crescita di funghi. 2-5 Questi terreni sono usati per l'isolamento di funghi da campioni clinici o materiali che potrebbero contenere contaminanti batterici. L'agar Sabouraud con glucosio è uno dei terreni usati per i test sui limiti microbici della USP e EP. 6,12 REAGENTI Formule: v. Tabella 1 PRECAUZIONI Solo per uso professionale. Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento, incrinature o altri segni di deterioramento. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. Tabella 1: REAGENTI

2 Formule* per litro di acqua purificata Nome del prodotto Glucose Agar Penicillin and Gentamicin and Streptomycin Chloramphenicol Ingredienti Digerito pancreatico 5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g di caseina Digerito peptico di 5,0 5,0 5,0 5,0 tessuto animale Glucosio 40,0 40,0 40,0 40,0 Agar 15,0 15,0 15,0 15,0 Penicillina G UI - - Streptomicina - 0,06 g - - Gentamicina - - 0,04 - Cloramfenicolo - - 0,4 0,4 ph ph 5,6 ± 0,2 5,6 ± 0,2 5,6 ± 0,2 5,6 ± 0,2 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per ulteriori informazioni, v. ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Per l'incubazione, v. nota a piè di pagina. Agar with Chloramphenicol Nome del prodotto Glucose Agar Penicillin and Gentamicin and Chloramphenicol Streptomycin Chloramphenicol Ceppi per test **Candida albicans ATCC **Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 ** Aspergillus brasiliensis ATCC16404 ** Penicillium roquefortii ATCC 9295 ***Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 *Staphylococcus aureus Nessuna inibizione Inibizione completa ATCC *Escherichia coli Nessuna ATCC inibizione Inibizione completa Non inoculate Ambrato chiaro Incubazione: *48 h C / **</= 5 days, C, aerobicamente. PROCEDURA Materiali forniti Glucose Agar, Chloramphenicol, Gentamicin and Chloramphenicol o Penicillin and Streptomycin, tutti su piastre impilate Stacker da 90 mm. Microbiologicamente controllate. PA

3 Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. Tipi di campioni Questi prodotti sono terreni di isolamento per funghi che possono essere utilizzati (alternativamente o in abbinamento) per tutti i campioni clinici (v. anche PERFORMANCE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). I terreni sono usati anche in molti campi della microbiologia industriale e nelle analisi igienico-sanitarie. Procedura del test Strisciare il campione non appena viene consegnato in laboratorio. La piastra strisciata è utilizzata prevalentemente per isolare le colture pure dai campioni contenenti flora mista. In alternativa, se il materiale in coltura proviene direttamente da un tampone, rotolare il tampone su una piccola area del bordo e strisciare da questa zona inoculata. Se il campione è costituito da cute scarificata, capelli o unghie, porre il materiale al centro del terreno. Per agevolare il contatto con il terreno, premere leggermente le particelle più grandi sulla superficie usando pinze sterili. Per individuare i dermatofiti, aggiungere anche BD Dermatophyte Agar o BD Mycosel Agar. Se vengono utilizzati Chloramphenicol, Agar with Gentamicin and Chloramphenicol o Penicillin and Streptomycin, aggiungere anche una piastra di Glucose Agar. Infine, per avere un'indicazione sui batteri patogeni presenti nel campione, inoculare anche un terreno non selettivo, tipo BD Columbia 5% Sheep Blood. Per l'identificazione dei lieviti (come Candida spp.) nei campioni clinici, incubare per 48 ore a C. Se si sospetta la presenza di funghi filamentosi, dermatofiti compresi, incubare a C per una settimana al massimo. In alcuni casi, i dermatofiti possono richiedere anche più di 3 settimane per svilupparsi. Per le analisi igienico-sanitarie, incubare a C fino a 7 giorni. Se l'incubazione dura più di 3 giorni, mantenere un adeguato livello di umidità. Le piastre possono essere sigillate con nastro adesivo per evitare l'essiccamento. Per informazioni più dettagliate su temperatura di crescita e incubazione, consultare la bibliogafia. 5,7-10 Risultati Dopo un adeguato periodo di incubazione, le piastre possono evidenziare colonie isolate nelle aree strisciate e crescita convergente nelle aree di inoculazione pesante. Ricercare sulle piastre colonie di funghi con colorazione e morfologia tipiche. Confermare i risultati con test biochimici e procedure microscopiche e sierologiche. 6-9 In considerazione dell'ampio numero di funghi patogeni, è impossibile descriverne l'aspetto in 2,3, 5-9 questa sede. Consultare la bigliografia. PERFORMANCE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA I terreni indicati in questo documento sono normalmente usati per l'isolamento e la coltura di funghi da tutti i tipi di campioni clinici e non clinici A causa dell'ampia varietà di temperature di crescita dei funghi, può essere necessario inoculare numerose piastre dello stesso terreno e incubarle a diverse temperature. Consultare la sezione 5, 7-10 Procedura del test e le relative voci della bibliografia. Glucose Agar è scarsamente selettivo, per cui i batteri crescono facilmente sul terreno, in particolare dopo un lungo periodo di incubazione. Se si sospetta contaminazione batterica di campioni, materiali o aree in esame, coltivare i campioni su terreni a più elevata selettività, come Chloramphenicol, Gentamicin and Chloramphenicol o Penicillin and Streptomycin. Nocardia e Actinomyces sono batteri filamentosi (non funghi!) e quindi non crescono su tutti i terreni Sabouraud contenenti inibitori batterici. PA

4 BIBLIOGRAFIA 1. Sabouraud, R Contribution a l'etude de la trichophytie humaine. Etude clinique, microscopique et bacterioloqique sur la pluralité des trichophytons de l'homme. Ann. Dermatol. Syphil. 3: Haley, L.D., J. Trandel, and M.B. Coyle Cumitech 11, Practical methods for culture and identification of fungi in the clinical microbiology laboratory. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Ajello, L., L.K. Georg, W. Kaplan, and L. Kaufman CDC laboratory manual for medical mycology. PHS Publication No. 994, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 4. MacFaddin, J.F Media for isolation-cultivation- identification-maintenance of medical bacteria. vol. I. Williams & Wilkins, Baltimore. 5. Sutton, D.A Specimen Collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. U.S. Pharmacopeial Convention, Inc The U.S. Pharmacopeia 32/The national formulary U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md. USA 7. Larone, D.H Medically important fungi: a guide to identification. 4 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Summerbell, R.C Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, and agents of superficial mycoses. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Kwon-Chung, K.J., and J.E. Bennett Medical mycology. Lea & Febiger, Philadelphia. 10. Pfaller, M.A., and R.A. Fromtling (section ed.) Mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 11. Brun, S., et al Evaluation of five commercial Sabouraud gentamicin-chloramphenicol agar media. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: Council of Europe, European Pharmacopoeia, 6.1. European Pharmacopoeia Secretariat. Strasbourg/France. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ Glucose Agar N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120 Chloramphenicol N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 Gentamicin and Chloramphenicol N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120 Penicillin and Streptomycin N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: [email protected] PA

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