I FITOPLASMI DELLA VITE

NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.1 I FITOPLASMI DELLA VITE Ana Maria Nazaré Pereira Universitade de Trás-os-Montes e Alto Duro Departamento de Protecção de Plantas, 5000-911 Vila Real (anazare@utad.pt) I FITOPLASMI: che cosa sono? I fitoplasmi sono parassiti vegetali unicellulari appartenenti alla classe dei Mollicutes. Hanno forma globulare (sferica) o ellissoidale e presentano polimorfismo a causa dell assenza della parete cellulare. Questi parassiti sono presenti nelle cellule floematiche della pianta ospite (Caudell, 1988; Agrios, 1997). Molte malattie vegetali di origine sconosciuta che si manifestano con ingiallimenti, deformazioni e/o appassimenti trasmesse per lo più da insetti, sono state spesso imputate a virus. Nel 1967, Doi et al (citati da Borges, 1975), osservarono per la prima volta, utilizzando il microscopio a trasmissione elettronica, corpi polimorfici, di diametro di 80-800 nm, sia nel preparato di cellule floematiche di numerose piante che presentavano ingiallimenti che nei preparati degli insetti vettori di quelle malattie. Questi organismi vennero denominati MLOs - organismi simili ai micoplasmi -, in quanto erano somiglianti ai micoplasmi già identificati quali agenti patogeni di numerose malattie negli animali e negli uomini. Nel 1994, il Subcommitee on the Taxonomy of Mollicutes, (Avinent e Llácer, 1994), decise di adottare il nome fitoplasma, in sostituzione di MLOs, per quei parassiti vegetali; si cominciò a lavorare sulla caratterizzazione molecolare dei fitoplasmi (Davis e Sinclair, 1998). Cousin (1995a) mise in evidenza le differenze tra i fitoplasmi, i batteri classici, i batteri presenti nei tessuti conduttori e i virus, ovvero tra tutti quei parassiti vegetali che causano avvizimenti e ingiallimenti nelle piante. QUALI SINTOMI CAUSANO? Il nome dato ai fitoplasmi è associato ai sintomi morfologici che determinano nella pianta ospite. Cambiamenti della colorazione delle foglie sono frequenti nelle malattie causate dai fitoplasmi. Nella vite (Vitis vinifera L.) la sintomatologia riguarda principalmente un germogliamento ritardato seguito da arricciamento fogliare e clorosi (o colorazione rossa delle foglie nei vitigni a bacca rossa) delle foglie estive. Tutte le varietà coltivate sono sensibili (in modo diverso) alla flavescenza dorata (FD), il fitoplasma più diffuso nel mondo (Torrubiano, 1998) la cui sintomatologia caratteristica può essere osservata in Fig. 1 e Fig. 2 (Caudwell, 1998). In primavera, il germogliamento è ritardato e le foglie rimangono piccole e dopo l estate presentano decolorazioni, ripiegamento della lamina fogliare verso il basso e ispessimento (Fig. 1). Nelle varietà bianche la malattia viene evidenziata da un colore giallo-oro in punti angolari lungo le nervature principali e talvolta necrotizzano (Fig. 2). Nelle varietà a bacca rossa, si può osservare un arrossamento precoce generalizzato o settoriale delimitato dalla nervatura principale. E importante non confondere nella vite la sintomatologia della FD con quella causata dal danno diretto della puntura della cicalina verde (Empoasca vitis Gothe, E. solani Curtis, E. decepiens Paoli e Jacobiasca lybica Bergevin & Zanon), insetto molto diffuso in Portogallo (Freitas e Sobrinho, 1999; Amaro, 2001). La fitotossicità di queste punture di suzione del tessuto floematico determina soprattutto lungo il bordo della lamina fogliare la formazione di chiazze rosse (o gialle nelle varietà da uva bianca) ben delimitate dalle nervature secondarie, facendo assumere alle foglie alla fine del periodo vegetativo un aspetto bruciato. L intensità del danno dipende dalla differente sensibilità varietale all insetto. E altresì importante non confondere i danni da FD con i danni causati dal virus dell arricciamento fogliare (associato al virus 3 - GLRaV-3), il virus più diffuso nei vigneti portoghesi. In questo caso i sintomi tipici sono oltre alla comparsa precoce di arrossamenti (o ingiallimenti nelle varietà da uva bianca) e arricciamenti fogliari, che conferiscono un aspetto pentagonale, anche la presenza lungo le nervature principali di zone di colore verde

NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.2 (Fig. 4). Le viti affette da FD hanno germogli che rimangono verdi e di consistenza gommosa con l avanzare della stagione, associate con macchie nere. Se i sintomi compaiono prima o durante la fioritura, tutta l infiorescenza dissecca. Se i sintomi appaiono verso la fine dell estate, il peduncolo secca e gli acini appassiscono e rimangono di consistenza fibrosa. (Caudwell, 1988). E importante notare che la presenza dei fitoplasmi nel vigneto non determina la malattia, poiché si possono trovare piante con fitoplasmi senza sintomi. L eziologia della malattia può solo essere stabilita solo in seguito alla trasmissione del fitoplasma da parte di un insetto vettore o l innesto da una pianta malata a una sana. CHE TIPO DI DANNO CAUSANO I FITOPLASMI? I fitoplasmi della vite ostruiscono i fasci cribrosi, dato che si moltiplicano nel floema. Di conseguenza, i prodotti della fotosintesi si accumulano nelle foglie e non riescono a raggiungere i luoghi dove vengono consumati o immagazzinati (Barrios et al, 1998); si può quindi verificare una forte diminuzione della produzione e un progressivo declino della pianta, che può morire nel caso delle varietà più sensibili, nel giro di pochi anni. Tra tutte le fitoplasmosi conosciute nella vite, la FD (Flavescenza dorata) risulta essere la più dannosa dal punto di vista economico, poiché è associata al vettore oligofago S. titanus. Questa cicalina è originaria del Nord America ed è diffusa nel Sud Europa e nei Paesi dell Est europeo (Boudon-Padieu, 2000). COME SONO TRASMESSI? In natura, i fitoplasmi sono trasmessi da pianta a pianta dagli insetti omotteri della famiglia dei Cicadellidae (cicaline), ma anche da insetti della famiglia degli Psyllidae (psille) e Fulgoridae. Attualmente vengono indicati come vettori della FD (Flavecenza dorata) il cicadellide Scaphoideus titanus Ball (= S. littoralis Ball) (Boudon-Padieu, 2000) e l insetto Metcalfa pruinosa (Say), introdotto recentemente in Europa (Guadagnini et al, 2000). L insetto polifago Hyalisthes obsoletus Signoret è il vettore di un altro fitoplasma della vite, responsabile della malattia del legno nero -BN (Sforza e Boudon-padieu, 1998; Maixner et al., 2001). Studi condotti in Francia e riportati da Avinent e Llácer (1994) indicano che S. titanus svolge una sola generazione all anno: l adulto depone le uova nella corteccia e nelle gemme invernali; le uova schiudono in aprile-maggio, si succedono cinque stadi giovanili (ninfe) che colonizzano presto le foglie (soprattutto la pagina inferiore); gli adulti muoiono in settembre-ottobre. E quindi in estate che le piante possono essere infettate. I fitoplasmi crescono e si moltiplicano nel canale alimentare, nell emolinfa, nelle ghiandole salivari e negli spazi intercellulari degli insetti vettori. Il periodo in cui il vettore riesce ad acquisire il fitoplasma (ninfe e adulti) è generalmente di molte ore, normalmente occorrono più di 24 ore; hanno normalmente un periodo di latenza di 10-45 giorni, la cui durata dipende dalla temperatura - più corto con temperature più elevate (Agrios, 1997, Avinent e Llácer, 1994). Questo periodo di incubazione serve per la moltiplicazione e la distribuzione nel corpo dell insetto del fitoplasma, che passa nell emolinfa e infetta diversi organi e le ghiandole salivari e viene trasmesso con la saliva alla pianta ospite, quando l insetto punge una pianta per nutrirsi. L insetto rimarrà quindi infettivo per tutta la sua vita. Dopo l inoculazione da parte del vettore, i sintomi risultanti dall azione del fitoplasma nella pianta ospite appariranno solo l anno successivo (Rivenez e Bonjotin, 1997), ma il periodo di incubazione potrebbe essere di tre anni (Boudon- Padieu, 2000). Secondo Avinent e Llácer (1994) la trasmissione meccanica o con il polline o ancora con i semi dei fitoplasmi non è stata ancora osservata. Come tutte le malattie infettive, i fitoplasmi sono trasmessi con l innesto, anche se la percentuale di trasmissione è condizionata dal momento in cui viene effettuato l innesto (Avinent e Llácer, 1994). L infezione primaria nel vigneto può originare sia dal materiale infetto che dalla trasmissione da parte degli insetti vettori. La diffusione nel vigneto da vite a vite avviene ad opera degli insetti vettori. la propagazione a livello regionale può avvenire anche mediante il trasporto di materiale infetto.

NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.3 In Portogallo, la cicalina S. titanus venne identificata per la prima volta nel 2000, in campioni raccolti nella regioni Entre Douro e Minho - Arcos de Valdevez e do Douro - Vila real (Quartau et al., 2001). La fig. 5 raffigura un adulto e una ninfa di S. titanus presi nella regione del Douro nel luglio 2001 (Quinta deprados, Vila Real). E importante evidenziare che molte specie di cicaline verdi, Empoasca vitis, E. solani, E. decepiens e Jacobiasca lybica che sono molto diffuse nei vigneti del Portogallo (Freitas e Sobrinho, 1999; Amaro, 2001) non sono vettori dei fitoplasmi nel vigneto. COME RICONOSCERE LA MALATTIA? I lavori di raccolta dati e gli studi di epidemiologia di una malattia riguardano diversi aspetti. La ricerca di una malattia può essere sufficiente per la misura qualitativa del materiale di propagazione, ma l identificazione e la caratterizzazione di un agente patogeno richiede ulteriori analisi. Quindi, la procedura per la ricerca e l identificazione delle fitoplasmosi della vite dipende dall obiettivo. I metodi per la ricerca e l identificazione delle fitoplasmosi della vite sono: - ricerca attraverso la sintomatologia. L osservazione in primavera-estate dei sintomi tipici associati alla cattura dei vettori nel vigneto può dare un indicazione di una possibile infezione da parte dei fitoplasmi, ma non è una procedura diagnostica, essendo comunque necessario un test di laboratorio per un eventuale conferma. I sintomi normalmente compaiono da uno a tre anni dopo l impianto di materiale infetto (Boudo-padieu, 2000). - ricerca mediante indexing biologico. Consiste nel testare materiale di propagazione utilizzando varietà sensibili al fitoplasma. Per quanto riguarda la FD (Flavescenza dorata) della vite, le piante indicatrici più utilizzate sono l ibrido Baco 22A, ma anche la V. vinifera cv Chardonnay e cv Aramon. Inoltre, per quanto riguarda la distribuzione irregolare dei fitoplasmi nella vite non è possibile utilizzare materiale in dormienza per la trasmissione artificiale; deve essere utilizzato l innesto dopo maggio, perché durante il riposo vegetativo i fitoplasmi si concentrano nelle radici, organo della pianta dove i fasci cribrosi mantengono la loro attività (Caudwell e Martelli, 1993; Avinent e Llácer, 1994). - ricerca in situ con coloranti. Per esempio il metodo DAPI; DAPI (4,6-diamino-2-fenilindolo) è un colorante specifico, che colora i batteri nel floema. Questa tecnica non permette però di distinguere i fitoplasmi dai batteri, che sono possibili agenti di patologie della vite, come la malattia di Pierce. - ricerca con l utilizzo del microscopio a trasmissione elettronica. I fitoplasmi possono essere osservati in tagli del tessuto floematico infetto e nei preparati di insetti infetti. - ELISA. Questo tipo di diagnosi è possibile per alcuni fitoplasmi di piante da frutto e di molte piante ornamentali. L identificazione dei fitoplasmi con questo metodo può essere fatta sia nelle piante che negli insetti vettori. E stato difficile ottenere materiale purificato sufficiente per la produzione di buoni anticorpi per i fitoplasmi della vite, a causa della distribuzione irregolare nella pianta e nel corso del periodo vegetativo e della loro presenza in piccole quantità (Boudon- Padieu, 2000). Per la vite non esistono ancora anticorpi in commercio facilmente disponibili (cataloghi del 2001). Comunque, in Francia si trovano anticorpi specifici per la Flavescenza dorata e per il marciume nero e la tecnica ELISA viene usata di routine dai servizi francesi di protezione delle piante contro i fitoplasmi (Boudon-Padieu, 2000). - identificazione con PCR-RFLP. La diagnosi basata sull analisi PCR (reazione della catena della polimerasi), seguita dalla digestione con enzimi di restrizione (RFLP) è stato il metodo più usato nell identificazione molecolare e nella caratterizzazione dei fitoplasmi (Davis e Sinclair, 1998; Lee et al., 1998), dopo lo sviluppo di primers per l amplificazione del DNA ribosomale dei fitoplasmi. QUALI FITOPLASMI SONO ASSOCIATI ALLA VITE? Per quanto riguarda la vite, la fitoplasmosi economicamente più importante è la flavescenza dorata, essendo l agente causale e il vettore originario dell America del Nord e poi diffuso in

NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.4 Europa. Boudon-Padieu (2000) hanno evidenziato nell ultimo convegno del ICVG i seguenti fitoplasmi della vite: - FD - Flavescenza dorata. Patologia riscontrata in Francia sin dagli anni 50, ma considerata virale fino al 1986. E un fitoplasma classificato nel gruppo EY o 16SrV (gruppo dell ingiallimento dell olmo). Sembra essere diffuso attualmente nel sud della Francia, nel Nord Italia, nella Spagna del Nord e in Germania. il vettore principale è lo Scaphoideus titanus, ma anche la Metcalfa pruinosa. - PGY - ingiallimenti della vite del Palatinato. E un fitoplasma del gruppo EY, ma diverso dal punto di vista molecolare dal fitoplasma della FD. Il vettore è Oncopsis alni. Per ora, questo fitoplasma sembra interessare solo la regione del Palatinato in Germania. - BN - marciume nero e VK - vergilbungskrankheit. Sono fitoplasmi del gruppo Stolbur (16SrXII) trovati in Francia, Germania, Svizzera, Italia, Ungheria, Croazia e Israele. Non sono trasmessi da una cicalina, ma dall insetto Hyalesthes obsoletus (Sforza e Boudon-Padieu, 1998; Maixner et al., 2001). - Fitoplasmi del gruppo AY (ingiallimento) trovati nei vigneti in Italia, Slovenia, Croazia e Israele. - Fitoplasmi del gruppo WX (fitoplasmi X dell ovest) trovati nei vigneti del Nord Italia, Israele, ma anche in America (VGYIII - ingiallimenti della vite della Virginia). - E tuttora in fase di caratterizzazione un altro fitoplasma appartenente al gruppo 16SrXII, trovato in Australia, conosciuto come ingiallimento della vite in Australia (AUSGY). COME SI COMBATTE LA PATOLOGIA? Il controllo delle fitoplasmosi nella vite non è facile. Fino ad oggi, sembra che la FD abbia un forte impatto economico solo in Francia e nel nord Italia, ma la sua presenza e quella dell insetto vettore già diffusi in molti altri paesi indica la possibilità di un ulteriore diffusione. Il lungo periodo di incubazione della malattia (fino a tre anni) fa sì che sia possibile impiantare un vigneto con materiale infetto e identificare la malattia solo dopo molti anni. In Francia, INRA e ENTAV stanno usando la termoterapia immergendo le radici e la parte aerea in acqua a temperatura di 50 C per 45 minuti per controllare la FD e BN (Geoffrion, 1998). Il monitoraggio dei vivai, osservando la presenza di sintomi spia (e la seguente analisi di laboratorio per l eventuale conferma) dovrebbe essere una pratica raccomandata. Le piante presenti nei vigneti che sono potenziali depositi di fitoplasmi e/o dell insetto vettore (Maixner et al, 2001) dovrebbero essere monitorate, specialmente nei vivai. QUAL E LA SITUAZIONE IN PORTOGALLO? I fitoplasmi in Portogallo sono organismi in quarantena. Fino ad oggi, nessun fitoplasma è stato ancora identificato in Portogallo, ma per quanto ne sappiamo, non sono stati eseguiti test di laboratorio. Adulti e ninfe di S. titanus, vettore della FD sono stati trovati nel Nord del Portogallo (nelle regioni Entre-Douro e Minho) nel 2000 e 2001 (Quartau et al, 2001); per questa ragione è consigliabile valutare se la sua presenza è sporadica o se, viceversa l insetto si è già inserito stabilmente. Considerando l importanza economica della vite in Portogallo, la facilità di circolazione del materiale vegetativo, il danno potenziale della FD e la presenza del vettore in Portogallo, consideriamo urgente effettuare un monitoraggio più attento sia del vettore che del organismo patogeno, completato da test di laboratorio per l identificazione dei fitoplasmi della vite. Agrios, G. N. 1997. Plant pathology. 4º edição, Academic Press, London, 635 p. Amaro, P. (Ed). 2001. A protecção integrada da vinha na região Norte. ISA /PRESS, 148 p. Avinant, L. e Llácer, G.1994. Fitoplasmas y espiroplasmas fitopatógeneos. In Patología vegetal. Tomo I. Coedición 2000, Phytoma-España e Grupo Mundi-Prensa, Barcelona, pp443-488.

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NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.6 Fig. 1 - Clorosi ed arricciamento delle foglie di Baco 22 A infettata da flavescenza dorata (A. Caudwell, 1988). Fig. 2 Ripiegamento dei lembi fogliari e necrosi delle nervature principali in una foglia di Baco 22 A infettata da flavescenza dorata (A. Caudwell, 1988). Fig. 3 Macchie ben delimitate dalle nervature secondarie risultanti dalla fitossicità delle punture da cicalina verde, Empoasca vitis (A. Caudwell, 1988).

NAZARE PEREIRA, I FITOPLASMI DELLA VITE, PAG.7 Fig. 4 Arricciamento fogliare con viraggio precoce e mantenimento del colore verde delle nervature principali come risultato dell infezione da GLRaV3 (foto di M. Carvalho, Vila Real,1997). Fig. 5 - Adulto e ninfa di S. titanus (foto di L. Torres, Vila Real, 2001).