Documento di sintesi

ISO/TR 3843 Validazione della performance di metodo dello Pseudalert*/Quanti-Tray*, per l analisi quantitativa dello ps.aeruginosa in acqua. May One IDEXX Drive Westbrook, Maine 49 USA idexx.it IDEXX Laboratories, Inc. tutti i diritti riservati. 588- *Pseudalert e Quanti-Tray sono marchi o marchi registrati di IDEXX Laboratories, Inc. o delle sue societa affiliate negli Stati Uniti e/o in altri stati. BD BBL and BD BBL Crystal sono marchi della Becton, Dickinson and Company. Il regolamento di protezione della privacy e disponibile su idexx.com

Documento di sintesi Il metodo Pseudalert*/Quanti-Tray* è progettato per la stima del numero più probabile (Most Probable Number, MPN) di Pseudomonas aeruginosa presente nell acqua di piscine e centri termali e nell acqua imbottigliata. Il test Pseudalert utilizza una tecnologia basata su un enzima batterico che segnala la presenza di P. aeruginosa attraverso l idrolisi di un substrato fluorogenico. Quanti-Tray è progettato per produrre conte batteriche quantitative basate sul metodo MPN a partire da campioni da ml, con l utilizzo di reagenti specifici per l organismo bersaglio. Il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è stato validato in conformità allo standard ISO/TR 3843:. Il metodo è stato messo alla prova con colture pure di 3 ceppi di P. aeruginosa, 9 ceppi di altre specie di Pseudomonas e 5 ceppi di altri batteri acquatici comuni. Tutti i 3 ceppi di P. aeruginosa hanno prodotto una forte fluorescenza blu sotto una luce ultravioletta (UV) di 365 nm, mentre nessuno degli altri batteri ha prodotto alcuna fluorescenza. La tabella seguente mostra una sintesi dei risultati delle valutazioni di sensibilità, specificità, selettività e robustezza dei conteggi. Sensibilità 94% Specificità % Selettività -,3 Tasso di falsi positivi <% Tasso di falsi negativi 6,5% Efficacia 97% Ripetibilità, Riproducibilità,7 I dati delle conte dopo il periodo di incubazione raccomandato di 4-8 ore hanno dimostrato la validità del metodo, ma a causa di alcuni ceppi a crescita più lenta o deboli produttori di enzimi, a 8 ore di incubazione può verificarsi un aumento della conta, rispetto a quella effettuata a 4 ore di incubazione. I risultati per Pseudalert dopo 4 ore di incubazione si sono dimostrati almeno altrettanto sensibili di quelli del metodo ISO 666 (dopo 44 ore di incubazione e conferma). Un incubazione superiore alle 4 ore con Pseudalert ha mostrato un leggero aumento nelle conte. Si tratta di un fenomeno ampiamente riconosciuto, in particolare per i batteri ambientali. Tuttavia, a condizione che l aumento nelle conte dopo un incubazione prolungata non sia eccessivo, le conte dopo 4 ore di incubazione sono considerate accettabili per ragioni pratiche e operative. Il substrato presente in Pseudalert ha una durata di mesi se conservato ad una temperatura tra i 4 e i 3 C. I dati relativi a tre ceppi di riferimento di P. aeruginosa, analizzati con lo stesso lotto del substrato conservato a 4 C e 3 C, non hanno mostrato differenze significative nel rendimento se conservato fino a 98 giorni. Le due temperature rappresentano gli estremi dello spettro di temperature raccomandato per la conservazione. Test successivi hanno dimostrato che Pseudalert è stabile per almeno un anno se conservato a una temperatura tra i 4 e i 3 C. Il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è stato confrontato con il metodo ISO 666 usando Pseudomonas CN secondo i requisiti ISO 7994:4. Sono stati preparati centotrenta campioni tramite l inoculazione in acqua da piscina privata del cloro di 3 ceppi di P. aeruginosa (contenenti una selezione di ceppi ATCC di riferimento, ceppi ambientali ottenuti dalla U.K. Health Protection Agency e ceppi ambientali raccolti

da IDEXX Laboratories, Inc.), in modo da generare campioni per ciascun ceppo. I risultati delle analisi ISO 7994 a un ala sono riassunti di seguito. Studio DRM% DS x L x H Conclusioni Pseudalert a 4 ore vs. ISO 666 6,36 9,99,,9 Pseudalert a 8 ore vs. ISO 666, 3,35 6,68 6,76 Pseudalert significativamente maggiore Pseudalert significativamente maggiore Bibliografia ISO/TR 3843:(E) Water Quality Guidance on validation of microbiological methods. Ginevra: International Organisation for Standardization. ISO 666:6 Water Quality Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa Method by membrane filtration. Ginevra: International Organisation for Standardization. ISO 7994:4 Water Quality Criteria for establishing equivalence between microbiological methods. Ginevra: International Organisation for Standardization.

Introduzione Il metodo Pseudalert*/Quanti-Tray* è progettato per la stima del numero più probabile (Most Probable Number, MPN) di Pseudomonas aeruginosa nell acqua di piscine e centri termali e nell acqua imbottigliata. Pseudalert utilizza una tecnologia basata su un enzima batterico che segnala la presenza di P. aeruginosa attraverso l idrolisi di un substrato fluorogenico diagnostico per il batterio. Il reagente Pseudalert viene miscelato con ml del campione e sottoposto a incubazione come test presenza/assenza (PA) o MPN. Il batterio P. aeruginosa è in grado di crescere rapidamente grazie alla presenza del substrato, che è ricco di aminoacidi, vitamine e altri nutrienti selezionati utilizzabili dal batterio. Quando la P. aeruginosa metabolizza il substrato enzimatico, il campione produce una fluorescenza blu se esposto ad una luce ultravioletta (UV) di 365 nm. Pseudalert permette il rilevamento della P. aeruginosa a mpn/ ml entro 4 ore (6 ore per l acqua gassata in bottiglia) con la soppressione di batteri non-bersaglio multipli selezionati in numeri fino a 5 x 3 per campioni da ml per batterio nonbersaglio. Con la metodologia presenza/assenza, possono essere analizzati campioni da o 5 ml. Quanti-Tray è progettato per produrre conte batteriche quantitative a partire da campioni da ml, con l utilizzo di substrati specifici per l organismo ricercato. La miscela reagente/campione viene versata all interno di un Quanti-Tray e sigillata con il Quanti-Tray* Sealer prima dell incubazione. Il contenitore è progettato in modo che, dopo la sigillatura, ci siano 5 pozzetti contenenti la miscela reagente/campione. Il sigillatore è un dispositivo a motore, costituito da un rullo riscaldato e progettato per sigillare un Quanti-Tray. I pozzetti positivi vengono conteggiati e il numero MPN di P. aeruginosa viene letto dall apposita tabella. Campo di applicazione del metodo Pseudalert/Quanti-Tray Il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è progettato principalmente per l analisi di acque di piscine e simili e per l analisi di acqua gassata o naturale in bottiglia. 3 Identificazione dell organismo bersaglio (paragrafi.. e 9. di ISO/TR 3843) Nel metodo Pseudalert/Quanti-Tray, i batteri del tipo P. aeruginosa sono quelli che producono un qualsiasi grado di fluorescenza blu se esposti a una luce UV di 365 nm durante il metabolismo del substrato fluorogenico diagnostico. 3. Test in coltura pura (paragrafo.. di ISO/TR 3843) Le reazioni in presenza di batteri bersaglio e non-bersaglio sono state confermate tramite il test di Pseudalert su colture pure di ceppi di riferimento ricavati dall American Type Culture Collection (ATCC), ceppi ambientali di P. aeruginosa, altre specie di Pseudomonas e altre Pseudomonadaceae affini e batteri Gram-positivi e Gram-negativi. Le reazioni tipiche di questi ceppi di riferimento e ambientali sono riportate nella tabella 3.-. 3

Tabella 3.- Ceppi di riferimento di P. aeruginosa, altre specie di Pseudomonas e Pseudomonadaceae affini e batteri Gram-positivi e Gram-negativi selezionati utilizzati per confermare le tipiche reazioni positive e negative con Pseudalert* Nota: i batteri bersaglio (P. aeruginosa) sono stati miscelati a una concentrazione di <5 cfu/ ml. I batteri non-bersaglio sono stati miscelati a una concentrazione di circa 5-5.cfu/ ml. Batterio Fonte Reazione con Pseudalert P. aeruginosa ATCC 45 Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fluorescens Pseudomonas huttiensis Pseudomonas luteola Pseudomonas mendocina Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas sp. Burkholderia cepacia Gruppo della B. cepacia Sphingomonas paucimobilis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Escherichia coli Serratia fonticola Serratia marcescens Serratia sp. Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis ATCC 97 ATCC 568 ATCC 354 ATCC 35554 Isolato da acque reflue Pa 3 Isolato acqueo Pa 8 Isolato acqueo Pa 3 Isolato acqueo Pa 34 Isolato acqueo Pa 37 Isolato da acqua in bottiglia Isolato da acqua in bottiglia Isolato da test valutativo Isolato da test valutativo Isolato da test valutativo 3 Isolato da acqua termale Pa 4 Isolato da acqua termale Pa 43 Isolato da acqua termale Pa 44 Isolato da acqua termale Pa 45 Isolato clinico Pa 46 Isolato clinico Pa 47 Isolato clinico Pa 48 Isolato acqueo ATCC 355² Isolato da acqua in bottiglia Pf 3 ATTC 467 Isolato acqueo Isolato acqueo Pm ATCC 633 Isolato da refrigerante atmosferico Isolato acqueo ATCC 7765 Isolato da acqua in bottiglia ATTC 89 Isolato acqueo Isolato acqueo ATCC 8739 ATCC 75 ATCC 59² Isolato da acque reflue Esc 3 ATCC 9845 Isolato da refrigerante atmosferico ATCC 4386 Isolato da acque reflue Contaminante della brodocoltura ATCC 3386 4 3. American Type Culture Collection (ATCC). ATCC 45, ATCC 355 e ATCC 59 sono utilizzati come organismi per il controllo qualità di Pseudalert. 3. Luce UV di 365 nm

3. Studi sulla sensibilità, specificità, tassi di falsi positivi/negativi, efficacia e selettività (ISO/TR 3843, paragrafo 9.) Per quanto riguarda i metodi microbiologici, queste caratteristiche sono definite da ISO/TR 3843: a) Veri positivi: numero di presunti positivi rivelatisi positivi b) Falsi negativi: numero di presunti negativi rivelatisi positivi c) Falsi positivi: numero di presunti positivi rivelatisi negativi d) Veri negativi: numero di presunti negativi rivelatisi negativi ) Sensibilità = a/(a + b) (la frazione dei positivi totali assegnati correttamente nella conta presunta) ) Specificità = d/(c + d) (la frazione dei negativi totali assegnati correttamente nella conta presunta) 3) Tasso di falsi positivi = c/(a + c) (la frazione dei positivi osservati assegnati in modo scorretto) 4) Tasso di falsi negativi = b/(b + d) (la frazione dei negativi osservati assegnati in modo scorretto) 5) Efficacia (E) = (a + d)/n 6) Selettività (F) = log [(a+c) / (a+b+c+d)] Per Pseudalert*, queste caratteristiche si riferiscono al numero di pozzetti positivi che contenevano effettivamente il batterio bersaglio (P. aeruginosa) e al numero di pozzetti negativi che erano effettivamente negativi per il batterio bersaglio. La valutazione della sensibilità, specificità e selettività di Pseudalert è stata effettuata tramite l individuazione di isolati positivi dai pozzetti fluorescenti positivi, generati tramite l uso di campioni derivati dalla miscela di acqua di piscina privata del cloro con 3 ceppi di P. aeruginosa (contenenti una selezione di ceppi ATCC di riferimento, ceppi ambientali ottenuti dalla U.K. Health Protection Agency e ceppi ambientali raccolti da IDEXX Laboratories, Inc.). Le informazioni sui ceppi selezionati sono contenute nell Appendice A, Tabella A-. Una quantità sufficiente di acqua di piscina è stata miscelata in modo da ottenere dieci campioni da ml per l analisi di ciascun ceppo di P. aeruginosa. Dopo l incubazione, sono stati selezionati 5 pozzetti fluorescenti da ciascun gruppo di campioni (-3 pozzetti da ogni campione) per ciascun ceppo di P. aeruginosa usato. Questi sono stati selezionati in modo da garantire che tutta la gamma di intensità di fluorescenza rilevate fosse rappresentata. In modo simile, sono stati selezionati 5 pozzetti negativi per ciascun ceppo al fine dell isolamento di potenziali batteri presenti. Di conseguenza, è stata effettuata una sottocoltura di 35 pozzetti positivi e 35 negativi al fine dell isolamento di eventuali batteri presenti. Gli isolati sono stati identificati tramite il kit di identificazione BBL* Crystal* enterico/non fermentante (E/NF) e il rispettivo software (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, U.S.A.), un sistema di identificazione miniaturizzato. Sono stati ottenuti isolati da 34 su 35 pozzetti fluorescenti sottoposti a sottocoltura. La mancata crescita in uno dei pozzetti positivi è stata causata da un errore di laboratorio. I profili di ossidasi e BBL Crystal E/NF e le identificazioni di questi isolati sono presentati nell Appendice A, Tabella A-. Sono stati tutti identificati come P. aeruginosa. 5

Trecentoventicinque pozzetti negativi sono stati sottoposti a sottocoltura e di questi hanno restituito colonie positive all ossidasi. Sono state tutte identificate come P. aeruginosa dal sistema BBL Crystal E/NF. Si veda l Appendice A, Tabella A-3. Tabella 3.- Sensibilità, specificità, tassi di falsi positivi e falsi negativi, efficacia e selettività del sistema Pseudalert*/Quanti-Tray* Caratteristica Risultato Sensibilità 94% Specificità % Tasso di falsi positivi <% Tasso di falsi negativi 6,5% Efficacia 97% Selettività -,3 I risultati dell analisi dei dati mostrano che, per la P. aeruginosa, il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è molto sensibile e specifico per il batterio bersaglio, con un tasso di falsi positivi inferiore allo, (ovvero <%). È stato anche rilevato un tasso di falsi negativi di,65. Ciò può essere dovuto alla sollecitazione alla quale sono stati sottoposti i batteri durante l inoculazione nell acqua di piscina, il che ha causato una risposta più lenta della reazione. Il metodo è molto selettivo, con un valore di -,3, migliore rispetto al valore guida di - suggerito da ISO/TR 3843 per i metodi di conta delle colonie. Si può anche affermare che il metodo è molto efficace per la P. aeruginosa, con un valore di efficacia di,97. 4 Incertezza di conteggio (ISO 3843, paragrafo.. e Allegato B) La ripetibilità e la riproducibilità sono due criteri per la valutazione dell affidabilità che possono essere ottenuti con un metodo analitico. Si può trattare di valutazioni dell intero metodo, con l uso di campioni naturali appropriati, o dell incertezza di conteggio associata alla lettura dei risultati di un metodo. I risultati ottenuti con l utilizzo di qualsiasi metodo dipendono dalla facilità con la quale chi analizza riesce a contare le colonie o le reazioni MPN positive. Tale facilità dipende dal carattere distintivo della morfologia coloniale degli organismi bersaglio e non-bersaglio in un agar di enumerazione o dalla chiarezza delle reazioni positive o negative in test MPN basati su una brodocoltura. La valutazione dell incertezza di conteggio può, quindi, fornire un indicazione dei potenziali problemi che si possono verificare nel caso in cui un metodo venga adottato su larga scala. La ripetibilità (r) e la riproducibilità (R) sono definite come segue: ripetibilità Riproducibilità Livello di corrispondenza con i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando, eseguite in presenza delle stesse condizioni di misurazione Livello di corrispondenza con i risultati di misurazioni dello stesso misurando, eseguite in presenza di condizioni di misurazione diverse Nel caso del conteggio di colonie microbiologiche su una piastra di terreno agarizzato o di reazioni positive in un test MPN, le condizioni uguali o diverse sono rappresentate dal ricercatore che esegue il conteggio. Così, in questo contesto, la ripetibilità è la corrispondenza delle conte ottenute dai conteggi ripetuti da parte di un ricercatore e la riproducibilità è la corrispondenza tra le conte ottenute da conteggi ripetuti effettuati da due o 6

più ricercatori. La valutazione della riproducibilità è generalmente più esaustiva rispetto alla valutazione della ripetibilità. L Allegato B di ISO/TR 3843 fornisce alcune linee guida sulla valutazione della ripetibilità e riproducibilità del conteggio con l uso delle deviazioni standard relative (relative standard deviation, RSD) di conteggi ripetuti. Inoltre, nell allegato, si raccomanda un valore di RSD inferiore a, (cioè una deviazione non superiore al %) quando si utilizzano colture pure. Gli studi sull incertezza di conteggio sono stati condotti da ricercatori IDEXX. I dati sono presentati nell Appendice B. Il conteggio è stato rilevato in modo che ciascun ricercatore non fosse a conoscenza delle conte degli altri. Il numero di pozzetti positivi è stato registrato separatamente per ciascun ricercatore. Il conteggio è stato effettuato dopo 4 ore di incubazione dei campioni e, nuovamente, dopo 8 ore di incubazione dei campioni. Le RSD calcolate per i pozzetti positivi da Pseudalert*/Quanti-Tray* nei quali è stato inoculato un ceppo di riferimento di P. aeruginosa (ATCC 7853) sono mostrate di seguito. Tabella 4- Ripetibilità e riproducibilità di Pseudalert 4 h di incubazione 8 h di incubazione ripetibilità,,6 Riproducibilità,7,3 I valori del conteggio dei pozzetti fluorescenti positivi di P. aeruginosa sono al di sotto del valore guida di <, (ISO/TR 3843, paragrafo B), il che indica che con il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è possibile ottenere un conteggio affidabile dei pozzetti positivi. 5 Robustezza, sensibilità nel tempo (paragrafi.. e B.4 di ISO/TR 3843) Ci sono due aspetti della robustezza pertinenti al metodo Pseudalert/Quanti-Tray: ) Il periodo di incubazione raccomandato di 4-8 ore ) Il periodo di conservazione di un massimo di mesi, con conservazione del reagente Pseudalert al riparo da fonti di luce e a una temperatura compresa tra i 4 e i 3 C 5. Robustezza del periodo di incubazione Conte accoppiate di analisi (condotte in duplicato) di sospensioni di ridotte quantità di colture di riferimento e ambientali di P. aeruginosa sono state effettuate dopo 4 e 8 ore di incubazione. Tutti i campioni sono stati testati con lo stesso lotto di test Pseudalert. L incubazione è stata effettuata a una temperatura di 38 C ±,5 C. I 44 risultati accoppiati sono presentati nell Appendice C, Tabella C-. Sono stati ottenuti gli stessi risultati per 36 delle conte accoppiate dopo i due tempi di incubazione. Delle restanti 8 conte accoppiate, 7 hanno mostrato un aumento di solo pozzetto positivo a 8 ore. La restante coppia di conte ha mostrato un aumento significativo per dei campioni duplicati del ceppo di P. aeruginosa (isolato del test di valutazione ), senza alcun aumento nell altra analisi accoppiata. Tutti gli isolati di riferimento e la stragrande maggioranza degli isolati provenienti da diversi tipi di acqua non hanno mostrato alcun aumento nel numero di pozzetti positivi a 8 ore di incubazione. I dati mostrano che, per la P. aeruginosa, il periodo di incubazione raccomandato di 4-8 ore è adeguato, ma si è notato che alcuni ceppi a crescita più lenta o deboli produttori di enzimi,possono contribuire ad una conta più elevata a 8 ore di incubazione. L aumento della conta in un periodo di incubazione raccomandato (es. -4 ore o 4-48 ore per il metodo della filtrazione con membrana, come ISO 666) è un fenomeno largamente riconosciuto, in particolare per i batteri ambientali. Tuttavia, a condizione che 7

l aumento nelle conte dopo un incubazione prolungata non sia eccessivo, le conte dopo 4 ore di incubazione sono considerate accettabili per ragioni pratiche e operative. 5. Robustezza del periodo di conservazione di Pseudalert Sospensioni di quantità ridotte di tre ceppi di riferimento ATCC di P. aeruginosa sono state analizzate tramite l uso di un singolo lotto di test Pseudalert che erano stati conservati per un massimo di 98 giorni a una temperatura sia di 4 che di 3 C. Una replica di tali campioni è stata analizzata dopo 4 e 8 ore di incubazione. I risultati sono esposti nell Appendice C, rispettivamente nelle Tabelle C- e C-3. Il reagente usato con Pseudalert ha una durata di mesi se conservato ad una temperatura tra i 4 e i 3 C. I dati relativi a tutti e tre i batteri analizzati con lo stesso lotto e conservati alle due temperature, non hanno mostrato differenze significative nel rendimento del reagente se conservato fino a 98 giorni. Le due temperature rappresentano gli estremi dello spettro di temperature raccomandato per la conservazione dello Pseudalert. Test successivi hanno dimostrato che Pseudalert è stabile per almeno un anno se conservato a una temperatura compresa tra i 4 e i 3 C. 6 Limite superiore per il funzionamento (paragrafi..4 e 6.3.3 di ISO/TR 3843) Il test Pseudalert/Quanti-Tray è un metodo MPN con un range di conteggio arbitrario che va da a, stabilito dal numero di pozzetti presenti nel contenitore Quanti-Tray. Secondo il paragrafo 6.3.3 di ISO/TR 3843, non è possibile stabilire alcun limite superiore per metodi MPN per motivi pratici e statistici, poiché la precisione non dipende in modo semplice dal numero di particelle introdotte nel set per l indagine. 7 Precisione (ISO/TR 3843, paragrafi..5 e 9.5.5) La precisione di un metodo MNP è data dagli intervalli di confidenza del 95% calcolati per ciascun valore MPN (ISO/TR 3843, paragrafo 9.5.5). Gli intervalli di confidenza per le conte di Pseudalert/Quanti-Tray, calcolate utilizzando il programma messo a disposizione dalla FDA (Food and Drug Administration) statunitense nel Bacteriological Analytical Manual (BAM) sono presentati nell Appendice D. Una ripetibilità teorica per ciascun MPN può essere derivata dal MPN stesso e dai suoi intervalli di confidenza. Anche i valori di incertezza relativa per ciascun MPN (log DS, calcolato dai valori dell intervallo di confidenza del 95% del MPN) e la ripetibilità (incertezza standard relativa) come coefficienti di variazione (CV%) sono presentati anche nell appendice D. Questi valori di Poisson possono essere utilizzati come valori di precisione minima con i quali è possibile combinare eventuali dati appropriati in possesso di un laboratorio (es. sulla variazione nella decantazione, sul volume del test o sull incertezza del conteggio) per ottenere una stima generale della ripetibilità di ciascun MPN. 8 Recupero relativo (ISO/TR 3843, paragrafo..6 e ISO 7994) Il metodo Pseudalert/Quanti-Tray è stato confrontato con il metodo ISO 666 che utilizza il reagente Pseudomonas CN, secondo i requisiti ISO 7994. Sono stati preparati centotrenta campioni tramite l inoculazione in acqua da piscina privata del cloro di 3 ceppi di P. aeruginosa (contenenti una selezione di ceppi ATCC di riferimento, ceppi ambientali ottenuti dalla U.K. Health Protection Agency e ceppi ambientali raccolti da IDEXX Laboratories, Inc.), in modo da generare campioni per ciascun ceppo. http://www.fda.gov/food/scienceresearch/laboratorymethods/bacteriologicalanalyticalmanualbam/ucm9656.htm 8

La conta dei contenitori Pseudalert/Quanti-Tray è stata effettuata dopo 4 e 8 ore di incubazione. I valori MPN sono stati arrotondati per eccesso al numero intero più vicino. La conta sulle piastre ISO 666 è stata effettuata dopo e 45 ore di incubazione e confermata secondo procedura ISO 666. I dati confermati della conta per i due metodi accoppiati sono stati trasformati con un logaritmo naturale (ln) e la differenza relativa tra le conte per ciascuna coppia (x i ) è stata calcolata come [ln(a i ) ln(b i )] x % (in cui a i e b i stanno per le conte accoppiate confermate rispettivamente per i metodi di trial e riferimento). Dai dati, sono state calcolate la differenza relativa media (DRM) e la deviazione standard (DS). La valutazione dell equivalenza si basa sulla DRM e sull incertezza (uncertainty, U) estesa, in base alla DS della media (U = s/ n), dalla quale vengono calcolati i limiti inferiore (x L ) e superiore (x H ) dell'intervallo di confidenza. In base a questo approccio statistico e a una valutazione unilaterale, sono stati stabiliti i risultati dello studio comparativo. I risultati sono presentati nella Tabella 8- (i dati originali sono disponibili su richiesta). Il confronto degli MPN di Pseudalert/Quanti-Tray contati dopo 4 e 8 ore di incubazione con il metodo ISO 666, confermato dopo 44 ore di incubazione, ha mostrato che il metodo Pseudalert/Quanti-Tray produce mediamente conte significativamente maggiori per entrambe le tempistiche di misurazione rispetto al metodo ISO 666. Sono stati sottoposti a sottocoltura un totale di 34 pozzetti blu fluorescenti da Pseudalert*/Quanti-Tray* e tutti sono stati identificati come P. aeruginosa. Perciò, non ci sono state reazioni false positive. Tabella 8- Confronto tra il rendimento di Pseudalert/Quanti-Tray dopo 4 e 8 ore di incubazione e di ISO 666 per il conteggio di P. aeruginosa nell acqua Studio DRM% DS x L x H Conclusioni Pseudalert a 4 ore vs. ISO 666 6,36 9,99,,9 Pseudalert significativamente maggiore Pseudalert a 8 ore vs. ISO 666, 3,35 6,68 6,76 Pseudalert significativamente maggiore DRM% = differenza relativa media in percentuale DS = deviazione standard 9 Bibliografia ISO/TR 3843:(E) Water Quality Guidance on validation of microbiological methods. Ginevra: International Organisation for Standardization. ISO 666:6 Water Quality Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa Method by membrane filtration. Ginevra: International Organisation for Standardization. ISO 7994:4 Water Quality Criteria for establishing equivalence between microbiological methods. Ginevra: International Organisation for Standardization. 9

Appendice A Dati da studi di sensibilità, specificità e selettività (si veda il paragrafo 3.) Tabella A- Dati sulla fonte degli isolati di P. aeruginosa usati per testare Pseudalert*/Quanti- Tray* Ceppo n. HPA¹ PS-3, isolato acqueo Fonte HPA PS-, isolato da acqua termale 3 ATCC² 45, ceppo di riferimento 4 ATCC 7853, isolato da coltura ematica 5 ATCC 3554, ceppo di controllo qualità per prodotti API 6 Raccolta IDEXX, isolato acqueo 7 ATCC 97, isolato da infezione esterna da otite 8 ATCC 544, isolato da acqua imbottigliata da stabulario 9 ATCC 5668, isolato clinico HPA PS- (= NCTC³ 95), fonte sconosciuta, probabilmente clinica HPA PS-7, isolato da acqua potabile da nave HPA PS-9, lo stesso di NCTC 33, ceppo di riferimento 3 HPA PS-6, isolato da acqua termale. HPA = raccolta della UK Health Protection Agency. ATCC = American Type Culture Collection 3. NCTC = U.K. National Collection of Type Cultures

Tabella A- Identificazione di isolati dai pozzetti fluorescenti di Pseudalert*/Quanti-Tray* Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza. + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997.3 + 34335 P. aeruginosa,9997.4 + 34335 P. aeruginosa,9997.5 + 34335 P. aeruginosa,9997.6 + 34335 P. aeruginosa,9997.7 + 34335 P. aeruginosa,9997.8 + 34335 P. aeruginosa,9997 Nessuna crescita.9 (errore di laboratorio). + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997.3 + 34335 P. aeruginosa,9997.4 + 34335 P. aeruginosa,9997.5 + 34335 P. aeruginosa,9997.6 + 34335 P. aeruginosa,9997.7 + 34335 P. aeruginosa,9997.8 + 34335 P. aeruginosa,9997.9 + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9997.3 + 34335 P. aeruginosa,9997.4 + 34335 P. aeruginosa,9997.5 + 34335 P. aeruginosa,9997. + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998.3 + 34335 P. aeruginosa,9998.4 + 34335 P. aeruginosa,9998.5 + 34335 P. aeruginosa,9998.6 + 34335 P. aeruginosa,9998.7 + 34335 P. aeruginosa,9998.8 + 34335 P. aeruginosa,9998.9 + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998.3 + 34335 P. aeruginosa,9998.4 + 34335 P. aeruginosa,9998.5 + 34335 P. aeruginosa,9998.6 + 34335 P. aeruginosa,9998.7 + 34335 P. aeruginosa,9998.8 + 34335 P. aeruginosa,9998.9 + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998. + 34335 P. aeruginosa,9998

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza.3 + 34335 P. aeruginosa,9998.4 + 34335 P. aeruginosa,9998.5 + 34335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.6 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3,7 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.8 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.9 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.6 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.7 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.8 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.9 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.3 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.4 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.5 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.6 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.7 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.8 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.9 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.3 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.4 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.5 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.6 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.7 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.8 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.9 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4. + 3435 P. aeruginosa,9998

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 4 4.3 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.4 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 4.5 + 3435 P. aeruginosa,9998 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.3 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.4 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.5 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.6 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.7 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.8 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.9 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.3 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.4 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.5 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.6 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.7 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.8 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.9 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5. + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.3 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.4 + 343 P. aeruginosa,9996 5 5.5 + 343 P. aeruginosa,9996 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.3 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.4 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.5 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.6 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.7 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.8 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.9 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.3 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.4 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.5 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.6 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.7 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.8 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.9 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6. + 34335 P. aeruginosa,9997 3

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 6 6.3 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.4 + 34335 P. aeruginosa,9997 6 6.5 + 34335 P. aeruginosa,9997 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.3 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.4 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.5 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.6 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.7 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.8 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.9 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.3 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.4 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.5 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.6 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.7 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.8 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.9 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7. + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.3 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.4 + 333 P. aeruginosa,9999 7 7.5 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.3 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.4 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.5 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.6 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.7 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.8 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.9 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.3 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.4 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.5 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.6 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.7 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.8 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.9 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 8 8. + 333 P. aeruginosa,9999 4

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 8 8.3 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.4 + 333 P. aeruginosa,9999 8 8.5 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.3 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.4 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.5 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.6 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.7 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.8 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.9 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.3 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.4 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.5 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.6 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.7 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.8 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.9 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9. + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.3 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.4 + 333 P. aeruginosa,9999 9 9.5 + 333 P. aeruginosa,9999. + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998.3 + 33 P. aeruginosa,9998.4 + 33 P. aeruginosa,9998.5 + 33 P. aeruginosa,9998.6 + 33 P. aeruginosa,9998.7 + 33 P. aeruginosa,9998.8 + 33 P. aeruginosa,9998.9 + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998.3 + 33 P. aeruginosa,9998.4 + 33 P. aeruginosa,9998.5 + 33 P. aeruginosa,9998.6 + 33 P. aeruginosa,9998.7 + 33 P. aeruginosa,9998.8 + 33 P. aeruginosa,9998.9 + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998. + 33 P. aeruginosa,9998 5

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza.3 + 33 P. aeruginosa,9998.4 + 33 P. aeruginosa,9998.5 + 33 P. aeruginosa,9998. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999.6 + 333 P. aeruginosa,9999.7 + 333 P. aeruginosa,9999.8 + 333 P. aeruginosa,9999.9 + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999.6 + 333 P. aeruginosa,9999.7 + 333 P. aeruginosa,9999.8 + 333 P. aeruginosa,9999.9 + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999.6 + 333 P. aeruginosa,9999.7 + 333 P. aeruginosa,9999.8 + 333 P. aeruginosa,9999.9 + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999.6 + 333 P. aeruginosa,9999.7 + 333 P. aeruginosa,9999.8 + 333 P. aeruginosa,9999.9 + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999. + 333 P. aeruginosa,9999 6

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza.3 + 333 P. aeruginosa,9999.4 + 333 P. aeruginosa,9999.5 + 333 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.6 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.7 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.8 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.9 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.6 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.7 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.8 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.9 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3. + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.3 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.4 + 3335 P. aeruginosa,9999 3 3.5 + 3335 P. aeruginosa,9999 7

Tabella A-3 Identificazione degli isolati dai pozzetti negativi di Pseudalert*/ Quanti-Tray* Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 + 34335 P. aeruginosa,9997 N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 + 34335 P. aeruginosa,9997 N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 + 34335 P. aeruginosa,9998 N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita 8

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3.3 Nessuna crescita 3 N3.4 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 N3.5 Nessuna crescita 3 N3.6 Nessuna crescita 3 N3.7 Nessuna crescita 3 N3.8 Nessuna crescita 3 N3.9 Nessuna crescita 3 N3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3.3 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 N3.4 Nessuna crescita 3 N3.5 Nessuna crescita 3 N3.6 Nessuna crescita 3 N3.7 Nessuna crescita 3 N3.8 Nessuna crescita 3 N3.9 + 3335 P. aeruginosa,9998 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. + 3335 P. aeruginosa,9998 3 N3.3 Nessuna crescita 3 N3.4 Nessuna crescita 3 N3.5 + 3335 P. aeruginosa,9998 4 N4. Nessuna crescita 4 N4. Nessuna crescita 4 N4.3 Nessuna crescita 4 N4.4 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 N4.5 Nessuna crescita 4 N4.6 Nessuna crescita 4 N4.7 Nessuna crescita 4 N4.8 Nessuna crescita 4 N4.9 Nessuna crescita 4 N4. + 3435 P. aeruginosa,9998 4 N4. Nessuna crescita 4 N4. Nessuna crescita 4 N4.3 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 N4.4 Nessuna crescita 4 N4.5 Nessuna crescita 4 N4.6 Nessuna crescita 4 N4.7 Nessuna crescita 4 N4.8 + 3435 P. aeruginosa,9998 4 N4.9 Nessuna crescita 4 N4. Nessuna crescita 4 N4. Nessuna crescita 4 N4. Nessuna crescita 4 N4.3 Nessuna crescita 4 N4.4 Nessuna crescita 4 N4.5 + 3435 P. aeruginosa,9998 9

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 5 N5. Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5.3 Nessuna crescita 5 N5.4 Nessuna crescita 5 N5.5 Nessuna crescita 5 N5.6 Nessuna crescita 5 N5.7 Nessuna crescita 5 N5.8 Nessuna crescita 5 N5.9 Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5.3 Nessuna crescita 5 N5.4 Nessuna crescita 5 N5.5 Nessuna crescita 5 N5.6 Nessuna crescita 5 N5.7 Nessuna crescita 5 N5.8 Nessuna crescita 5 N5.9 Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5. Nessuna crescita 5 N5.3 Nessuna crescita 5 N5.4 Nessuna crescita 5 N5.5 Nessuna crescita 6 N6. + 3433 P. aeruginosa,9999 6 N6. Nessuna crescita 6 N6.3 Nessuna crescita 6 N6.4 Nessuna crescita 6 N6.5 Nessuna crescita 6 N6.6 Nessuna crescita 6 N6.7 Nessuna crescita 6 N6.8 Nessuna crescita 6 N6.9 Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6.3 Nessuna crescita 6 N6.4 Nessuna crescita 6 N6.5 Nessuna crescita 6 N6.6 Nessuna crescita 6 N6.7 Nessuna crescita 6 N6.8 Nessuna crescita 6 N6.9 Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6. Nessuna crescita 6 N6.3 Nessuna crescita 6 N6.4 Nessuna crescita 6 N6.5 Nessuna crescita

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 7 N7. Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7.3 Nessuna crescita 7 N7.4 Nessuna crescita 7 N7.5 Nessuna crescita 7 N7.6 Nessuna crescita 7 N7.7 Nessuna crescita 7 N7.8 Nessuna crescita 7 N7.9 Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7.3 Nessuna crescita 7 N7.4 Nessuna crescita 7 N7.5 Nessuna crescita 7 N7.6 Nessuna crescita 7 N7.7 Nessuna crescita 7 N7.8 Nessuna crescita 7 N7.9 Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7. Nessuna crescita 7 N7.3 Nessuna crescita 7 N7.4 Nessuna crescita 7 N7.5 Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8.3 Nessuna crescita 8 N8.4 Nessuna crescita 8 N8.5 Nessuna crescita 8 N8.6 Nessuna crescita 8 N8.7 Nessuna crescita 8 N8.8 Nessuna crescita 8 N8.9 Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8.3 Nessuna crescita 8 N8.4 + 33 P. aeruginosa,9998 8 N8.5 Nessuna crescita 8 N8.6 Nessuna crescita 8 N8.7 Nessuna crescita 8 N8.8 Nessuna crescita 8 N8.9 Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8. Nessuna crescita 8 N8.3 Nessuna crescita 8 N8.4 Nessuna crescita 8 N8.5 Nessuna crescita

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 9 N9. Nessuna crescita 9 N9. Nessuna crescita 9 N9.3 Nessuna crescita 9 N9.4 Nessuna crescita 9 N9.5 Nessuna crescita 9 N9.6 Nessuna crescita 9 N9.7 Nessuna crescita 9 N9.8 Nessuna crescita 9 N9.9 Nessuna crescita 9 N9. Nessuna crescita 9 N9. Nessuna crescita 9 N9. + 33 P. aeruginosa,9998 9 N9.3 Nessuna crescita 9 N9.4 + 3433 P. aeruginosa,9999 9 N9.5 Nessuna crescita 9 N9.6 Nessuna crescita 9 N9.7 Nessuna crescita 9 N9.8 Nessuna crescita 9 N9.9 Nessuna crescita 9 N9. Nessuna crescita 9 N9. + 343 P. aeruginosa,9999 9 N9. Nessuna crescita 9 N9.3 + 343 P. aeruginosa,9999 9 N9.4 Nessuna crescita 9 N9.5 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 + 333 P. aeruginosa,9999 N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita N.6 Nessuna crescita N.7 Nessuna crescita N.8 Nessuna crescita N.9 Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N. Nessuna crescita N.3 Nessuna crescita N.4 Nessuna crescita N.5 Nessuna crescita 3

Ceppo n. Isolato n. Ossidasi Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3.3 Nessuna crescita 3 N3.4 Nessuna crescita 3 N3.5 Nessuna crescita 3 N3.6 Nessuna crescita 3 N3.7 Nessuna crescita 3 N3.8 Nessuna crescita 3 N3.9 Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3.3 Nessuna crescita 3 N3.4 Nessuna crescita 3 N3.5 Nessuna crescita 3 N3.6 Nessuna crescita 3 N3.7 Nessuna crescita 3 N3.8 Nessuna crescita 3 N3.9 Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3. Nessuna crescita 3 N3.3 Nessuna crescita 3 N3.4 Nessuna crescita 3 N3.5 Nessuna crescita 4

Appendice B Incertezza di conteggio per i pozzetti fluorescenti di Pseudalert*/Quanti-Tray* con inoculazione di P. aeruginosa ATCC 7853 (si veda il paragrafo 4) Tabella B- Dati di ripetibilità per la lettura dei pozzetti positivi dopo un incubazione con Pseudalert* di 4 ore Ricercatore A : Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 4 ore Campione Lettura Lettura Media DS RSD sq - 8 8 8,, -,, -3,, -4 9 9 9,, -5 9 9 9,, -6 3 3 3,, -7 3 3 3,, -8 5 6 5,5,77, -9,, - 5 5 5,, - 33 33 33,, - 9 9 9,, -3 3 33 3,5,77, -4 6 6 6,, -5 3 33 3,5,77, -6 8 8 8,, -7 6 5 5,5,77, -8 35 35 35,, -9 3 3 3,, - 35 34 34,5,77, 4-44 43 43,5,77, 4-43 43 43,, 4-3 43 43 43,, 4-4 4 4 4,, 4-5 4 4 4,, 4-6 4 4 4,5,77, 4-7 44 44 44,, 4-8 35 36 35,5,77, 4-9 43 43 43,, 4-36 36 36,, 6-46 45 45,5,77, 6-47 47 47,, 6-3 47 47 47,, 6-4 46 46 46,, 6-5 48 48 48,, 6-6 48 48 48,, 6-7 46 46 46,, 6-8 45 45 45,, 6-9 49 49 49,, 6-48 46 47,44, 8-5 49 49,5,77, 8-49 5 49,5,77, 8-3 5 5 5,, 5

Ricercatore A : Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 4 ore Campione Lettura Lettura Media DS RSD sq 8-4 5 5 5,, 8-5 5 5 5,, 8-6 5 5 5,, 8-7 5 5 5,, 8-8 5 5 5,5,77, 8-9 5 5 5,, 8-5 49 49,5,77, RSD totale,7 RSDc, 6

Tabella B- Dati di ripetibilità per la lettura di pozzetti positivi dopo un incubazione di 8 ore con Pseudalert* Ricercatore A : Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 8 ore Campione Lettura Lettura Media DS RSD sq -,, -,, -3,, -4,44,5-5 9 9 9,, -6 4 4 4,, -7 6 6 6,, -8 7 6 6,5,77, -9,, - 5 5 5,, - 33 33 33,, - 3 3 3,, -3 33 33 33,, -4 7 7 7,, -5 33 33 33,, -6 8 8 8,, -7 6 6 6,, -8 35 33 34,44, -9 3 3 3,, - 35 35 35,, 4-43 43 43,, 4-43 43 43,, 4-3 43 43 43,, 4-4 4 4 4,, 4-5 4 4 4,, 4-6 4 4 4,, 4-7 44 44 44,, 4-8 36 36 36,, 4-9 45 45 45,, 4-36 36 36,, 6-45 45 45,, 6-49 48 48,5,77, 6-3 48 45 46,5,, 6-4 46 46 46,, 6-5 48 48 48,, 6-6 49 48 48,5,77, 6-7 46 46 46,, 6-8 45 45 45,, 6-9 49 49 49,, 6-46 46 46,, 8-49 49 49,, 8-49 5 49,5,77, 8-3 5 5 5,, 8-4 5 5 5,, 8-5 5 5 5,, 8-6 5 5 5,, 8-7 5 5 5,, 8-8 5 5 5,, 8-9 5 49 5,44, 7

Ricercatore A : Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 8 ore Campione Lettura Lettura Media DS RSD sq 8-49 5 5,44, RSD totale, RSDc,6 8

Tabella B-3 Dati di riproducibilità per la lettura dei pozzetti positivi dopo un incubazione di 4 ore con Pseudalert* Tre ricercatori. Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 4 ore Campione A B C Media DS RSD sq - 8 8 9 8,3,577, -,,, -3,,, -4 9 9 9,3,577, -5 9 9 9 9,,, -6 3 3 4 3,3,577, -7 3 3 4 3,3,577, -8 5 6 7 6,,,4-9,,, - 5 5 5 5,,, - 33 33 33 33,,, - 9 9 3 9,7,55, -3 3 33 34 33,,, -4 6 6 6 6,,, -5 3 33 33 3,7,577, -6 8 8 8 8,,, -7 6 5 6 5,7,577, -8 35 35 36 35,3,577, -9 3 3 3 3,,, - 35 35 35 35,,, 4-44 43 43 43,3,577, 4-43 43 43 43,,, 4-3 43 43 43 43,,, 4-4 4 4 4 4,,, 4-5 4 4 4 4,,, 4-6 4 4 4 4,,, 4-7 44 43 43 43,3,577, 4-8 35 35 36 35,3,577, 4-9 43 43 45 43,7,55, 4-36 36 36 36,,, 6-46 45 46 45,7,577, 6-47 47 47 47,,, 6-3 47 46 46 46,3,577, 6-4 46 46 46 46,,, 6-5 48 48 48 48,,, 6-6 48 48 48 48,,, 6-7 46 46 46 46,,, 6-8 45 44 45 44,7,577, 6-9 49 49 49 49,,, 6-48 47 47 47,3,577, 8-5 49 49 49,3,577, 8-49 49 49 49,,, 8-3 5 5 5 5,,, 8-4 5 5 5 5,,, 8-5 5 5 5 5,,, 8-6 5 5 5 5,,, 8-7 5 49 5 49,7,577, 8-8 5 5 5 5,3,577, 8-9 5 49 5 5,,, 9

Tre ricercatori. Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 4 ore Campione A B C Media DS RSD sq 8-5 49 49 49,3,577, RSD totale,5 RSDc,7 3

Tabella B-4 Dati di riproducibilità per la lettura dei pozzetti positivi dopo un incubazione di 8 ore con Pseudalert* Tre ricercatori. Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 8 ore Campione A B C Media DS RSD sq -,,, -,,, -3 3 3,7,577, -4,,, -5 9 9 9 9,,, -6 4 4 4 4,,, -7 6 7 7 6,7,577, -8 7 8 8 7,7,577, -9,3,577, - 5 5 5 5,,, - 33 33 33 33,,, - 3 3 3 3,,, -3 33 34 34 33,7,577, -4 7 7 7 7,,, -5 33 33 33 33,,, -6 8 8 8 8,,, -7 6 6 6 6,,, -8 35 36 36 35,7,577, -9 3 3 3 3,3,577, - 35 35 35 35,,, 4-43 43 45 43,7,55, 4-43 43 43 43,,, 4-3 43 43 44 43,3,577, 4-4 4 4 4 4,,, 4-5 4 4 4 4,,, 4-6 4 4 4 4,7,577, 4-7 44 44 44 44,,, 4-8 36 36 36 36,,, 4-9 45 44 45 44,7,577, 4-36 36 37 36,3,577, 6-45 45 46 45,3,577, 6-49 48 48 48,3,577, 6-3 48 46 46 46,7,55, 6-4 46 46 46 46,,, 6-5 48 48 48 48,,, 6-6 49 48 48 48,3,577, 6-7 46 46 46 46,,, 6-8 45 45 45 45,,, 6-9 49 49 49 49,,, 6-46 47 47 46,7,577, 8-49 49 49 49,,, 8-49 49 49 49,,, 8-3 5 5 5 5,,, 8-4 5 5 5 5,,, 8-5 5 5 49 49,7,577, 8-6 5 5 5 5,,, 8-7 5 5 5 5,,, 8-8 5 5 5 5,,, 8-9 5 5 5 5,7,577, 3

Tre ricercatori. Lettura pozzetti positivi di Pseudalert a 8 ore Campione A B C Media DS RSD sq 8-49 49 49 49,,, RSD totale,8 RSDc,3 3

Appendice C Dati di robustezza per Pseudalert*/Quanti-Tray* (si veda il paragrafo 5) Tabella C- Conte replicate da sospensioni di ceppi di riferimento e ambientali di P. aeruginosa da Pseudalert*/Quanti-Tray* dopo 4 e 8 ore di incubazione. Fonte ATCC 45 ATCC 97 ATCC 568 ATCC 354 ATCC 35554 Isolato da acque reflue Pa 3 Isolato acqueo Pa 8 Isolato acqueo Pa 3 Isolato acqueo Pa 34 Isolato acqueo Pa 37 Isolato da acqua in bottiglia Isolato da acqua in bottiglia Isolato da test valutativo Isolato da test valutativo Isolato da test valutativo 3 Isolato da acqua termale Pa 4 Isolato da acqua termale Pa 43 Isolato da acqua termale Pa 44 Isolato da acqua termale Pa 45 Repliche Numero di pozzetti positivi 4 h 8 h % di cambiamento 9 9 6 6 5 5 6 6 7 7 3 3 6 6 3 3 8 8 3 3 6 6 9 9 6 6 8 8 8 9 + 6 % 4 4 4 9 + % 6 7 + 6 % 4 5 + 7 % 6 7 + 6 % 8 8 4 5 + 7 % 5 5 9 9 5 5 Isolato clinico Pa 46 Isolato clinico Pa 47 Isolato clinico Pa 48 9 3 3 5 3 9 3 3 5 4 + 9 % + 8 % 33

Tabella C- Conte replicate da sospensioni di tre ceppi di P. aeruginosa da Pseudalert*/Quanti-Tray* dopo 4 e 8 ore di incubazione con l uso di Pseudalert conservato a 4 C per un massimo di 98 giorni Numero di pozzetti positivi Giorni dalla produzione 4 h 8 h P. aeruginosa ATCC 45 % di cambiamento P. aeruginosa ATCC 7853 4 h 8 h % di cambiamento 4 h 8 h P. aeruginosa ATCC 35554 % di cambiamento 37 36 38 37 + 3 % + 3 % 5 6 36 + 73 % + 64 % 8 8 8 33 + 8 % 7 37 37 4 37 + % 5 3 9 3 + 6 % + 9 % 3 3 3 + 5 % 4 3 6 3 6 7 3 7 + 5 % 9 33 9 33 54 3 5 3 5 7 3 7 3 + 3 % 4 9 4 3 + 3 % 89 33 36 33 37 + 3 % 6 9 7 9 + 4 % 9 3 9 3 7 6 3 6 3 3 3 3 3 + 7 % 8 3 9 3 + 4 % 5 34 7 35 8 + 3 % + 4 % 3 3 + 3 % 36 3 36 3 + 3 % 8 9 7 9 9 + % 3 7 4 7 + 5 % 4 9 4 9 8 8 3 8 3 8 7 8 7 6 3 6 3 43 9 7 9 7 6 5 7 6 + 6 % + 4 % 3 3 77 5 6 + 4 % 7 9 7 + % 8 5 8 6 + 4 % 98 34 8 34 8 7 7 3 4 3 4 34

Tabella C-3 Conte replicate da sospensioni di tre ceppi di P. aeruginosa da Pseudalert*/Quanti-Tray* dopo 4 e 8 ore di incubazione utilizzando Pseudalert conservato a 3 C fino a un massimo di 98 giorni Giorni dalla produzione 7 4 54 89 7 5 8 8 43 77 98 4 h 8 h 37 36 35 3 34 6 4 8 34 36 37 33 6 7 8 5 8 3 6 P. aeruginosa ATCC 45 38 37 35 3 34 7 4 9 34 36 37 33 7 3 8 5 8 4 3 6 Numero di pozzetti positivi P. aeruginosa ATCC 7853 P. aeruginosa ATCC 35554 % di cambiamento 4 h 8 h % di cambiamento 4 h 8 h % di cambiamento + 3 % + 3 % + 4 % + 4 % + 4 % + % + 5 % + 4 % + 5 % 5 6 3 5 34 4 8 4 3 5 6 5 8 5 4 6 6 7 6 36 36 3 7 3 5 35 6 8 5 34 6 7 7 8 5 4 6 7 7 + 73 % + 64 % + 8 % + 6 % + 4 % + 3 % + 8 % + 4 % + 6 % + 4 % + 4 % + 8 % + 5 % + 6 % 8 8 3 38 3 9 9 34 5 9 3 6 34 7 4 34 7 3 3 3 9 3 8 33 5 4 3 9 3 35 5 9 3 6 34 7 4 34 7 3 3 3 9 3 + 8 % + 9 % + 5 % + 4 % + 3 % + 5 % 35

Appendice D Intervalli di confidenza del 95% e ripetibilità teorica per ciascun valore MPN (si veda il paragrafo 7) Tabella D- Intervalli di confidenza del 95% e ripetibilità teorica per ciascun valore MPN per Pseudalert*/Quanti-Tray* a 5 pozzetti Numero di pozzetti con reazione positiva MPN per campione da ml Intervalli di confidenza del 95% Inferiore Superiore Deviazione standard della ripetibilità (log DS) Ripetibilità teorica Incertezza standard relativa (%CV) <,, 3,7 - -,,3 5,6,4343,,,6 7,3,37 7,7 3 3,, 9,,58 57,7 4 4,,7,7,7 5, 5 5,3,3,3,943 44,7 6 6,4 3, 3,9,774 4,9 7 7,5 3,7 5,5,643 37,8 8 8,7 4,5 7,,537 35,4 9 9,9 5,3 8,8,45 33,4, 6,,5,376 3,7,4 7,,,33 3, 3,7 7,9 3,9,57 9, 3 5, 8,8 5,7,9 7,8 4 6,4 9,8 7,5,66 6,8 5 7,8,8 9,4,7 6, 6 9,,9 3,3,9 5, 7,7 3, 33,3,6 4,4 8, 4, 35,,3 3,8 9 3,8 5,3 37,3,5 3, 5,4 6,5 39,4,98,6 7, 7,7 4,6,959, 8,8 9, 43,9,938,6 3 3,6,4 46,3,99, 4 3,4,8 48,7,9,8 5 34,4 3,3 5,,885,4 6 36,4 4,7 53,9,87, 7 38,4 6,4 56,6,856 9,7 8 4,6 8, 59,5,843 9,4 36

Numero di pozzetti con reazione positiva MPN per campione da ml Intervalli di confidenza del 95% Inferiore Superiore Deviazione standard della ripetibilità (log DS) Ripetibilità teorica Incertezza standard relativa (%CV) 9 4,9 9,7 6,5,83 9, 3 45,3 3,5 65,6,89 8,9 3 47,8 33,4 69,,89 8,6 3 5,4 35,4 7,5,799 8,4 33 53, 37,5 76,,79 8, 34 56, 39,7 8,,783 8, 35 59, 4, 84,4,776 7,9 36 6,4 44,6 88,8,77 7,7 37 65,9 47, 93,7,765 7,6 38 69,7 5, 99,,76 7,5 39 73,8 53, 4,8,758 7,4 4 78, 56,4,,756 7,4 4 83, 59,9 8,3,756 7,4 4 88,5 63,9 6,,757 7,4 43 94,5 68, 35,4,76 7,5 44,3 73, 46,,768 7,7 45 9, 78,6 58,7,778 7,9 46 8,4 85, 74,5,794 8,3 47 9,8 9,7 95,,89 8,9 48 44,5,3 4,,859 9,8 49 65, 5, 7,,99,4 5,5 35,8 387,6,94 5, 5 >,5 46, infinito - - 37