Allestimento e valutazione del Proficiency Molecolare

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Graziano Biondi
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1 MoRoNet: la Rete Nazionale di Laboratori di Riferimento per il Morbillo e la Rosolia ISS - 20 marzo 2017 Allestimento e valutazione del Proficiency Molecolare Melissa Baggieri Laboratorio Nazionale di Riferimento per il morbillo e la rosolia Dipartimento di Malattie Infettive, ISS

2 10 LABORATORI CANDIDATI ALL ACCREDITAMENTO PER DIAGNOSI MOLECOLARE E DI QUESTI 9 LABORATORI CANDIDATI ALL ACCREDITAMENTO PER DIAGNOSI MOLECOLARE e GENOTIPIZZAZIONE

FTA CARDS una tecnologia che semplifica la manipolazione ed il processamento degli acidi nucleici contengono composti in grado di lisare le cellule, denaturare le proteine e proteggere gli acidi

3 FTA CARDS una tecnologia che semplifica la manipolazione ed il processamento degli acidi nucleici contengono composti in grado di lisare le cellule, denaturare le proteine e proteggere gli acidi nucleici dai danni dovuti agli enzimi cellulari, all ossidazione e all azione dei raggi ultravioletti inattivano rapidamente i microrganismi e non sono soggetti alla normativa IATA relativa alle merci pericolose non necessitano di trasporto refrigerato

colorimetrico che vira dal rosa al bianco in seguito

4 Indicating FTA micro Card - un'area di deposizione per l'applicazione di 125 µl di campione - con un indicatore colorimetrico che vira dal rosa al bianco in seguito all'applicazione del campione Ceppi virali isolati durante la sorveglianza di laboratorio del morbillo

5 PROVE SVOLTE SULLE FTA CARD Per stabilire: Numero di dischetti ottenuti da ogni card Concentrazione del campione Per confermare: Volume di campione Metodo di eluizione Per verificare: stabilità dell RNA nel tempo a T amb identità delle sequenze

6 ESPERIMENTO 1 Campione Mo 3187 Titolo Genotipo 4.25 TCID50/ml B3

7 125 ml 125 ml indiluito dil. 1:10 30 minuti a temperatura ambiente punzonati 12 dischetti del diametro di 6 mm Trasferiti un dischetto uno intero ed uno parzialmente impregnato in differenti provette

8 dopo 30 minuti

9 ELUIZIONE DEI DISCHETTI ed ESTRAZIONE RNA dischetti risospesi in 1,1 ml di H 2 O sterile apirogena incubando a temperatura ambiente per 20 minuti in agitazione l estrazione dell RNA virale è stata realizzata seguendo il metodo utilizzato di routine nel nostro laboratorio (Tissue Total RNA mini kit, Fisher Molecular Biology) Il resto del materiale (11 dischetti per ciascuna preparazione) è stato conservato per le successive prove

indiluito 1:10 RNA estratti dalla preparazione indiluita escono a 27-28 cicli RNA estratti dalla

10 indiluito 1:10 RNA estratti dalla preparazione indiluita escono a cicli RNA estratti dalla diluizione 1:10 escono a circa 31 cicli Non c è differenza tra i dischetti interamente o parzialmente impregnati

11 In base ai risultati ottenuti.. Abbiamo stabilito: Numero di dischetti ottenuti da ogni card: 12 Concentrazione del campione: indiluito Volume di campione: 150 ml Abbiamo confermato: Metodo di eluizione Ancora da verificare: la stabilità dell RNA nel tempo a T amb l identità delle sequenze

12 ESPERIMENTO 2 Testati 2 dischetti dopo 1, 2, 3 e 6 giorni dalla loro preparazione: Eluizione Estrazione Real-time G0, G1, G2 G3, G6

13 ESPERIMENTO 3 Testati 2 dischetti dopo 37 giorni dalla loro preparazione: Eluizione Estrazione Real-time G0 - G 37

14 RT-PCR PER SEQUENZIAMENTO I campioni di tutti gli esperimenti sono stati sequenziati ed abbiamo verificato la concordanza del 100% delle sequenze ottenute con quelle del ceppo isolato da cui siamo partiti

15 In base ai risultati ottenuti... Abbiamo stabilito: Numero di dischetti ottenuti da ogni card: 12 Concentrazione del campione: indiluito Volume di campione: 150 ml Abbiamo confermato: Metodo di eluizione Abbiamo verificato: la stabilità dell RNA fino a 37 giorni a T amb l identità delle sequenze

16 CAMPIONI TOTALI TESTATI Campione Titolo Genotipo Esito Mo TCID50/ml B3 POSITIVO Mo TCID50/ml D8 POSITIVO Mo TCID50/ml D9 POSITIVO Mo TCID50/ml B3 POSITIVO Mumps Vaccine (Urabe AM-9) NEGATIVO

17 SU DUE DISCHETTI PER OGNI PREPARAZIONE Eluizione Estrazione Real-time 3239, B3 3277, D8 3187, B3 3221, D9 MuV I campioni sono stati sequenziati ed abbiamo verificato la concordanza del 100% delle sequenze ottenute con quelle dei ceppi isolati

18 Allestimento del pannello

19 CAMPIONI SCELTI Mo 3187 Mo 3277 Mo 3221 Titolo 4.25 TCID 50 /ml 5.0 TCID 50 /ml 4.4 TCID 50 /ml Mumps Vaccine Urabe AM-9 Genotipo B3 D8 D9 Tot dischetti 2 x 10 lab 2 x 10 lab 2 x 10 lab 2 x 10 lab Volume 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml

20 Mo 3187, B3 150 ml 150 ml 150 ml Mo 3277, D8 150 ml 150 ml 150 ml Mo 3221, D9 150 ml 150 ml 150 ml Mumps Vaccine (Urabe AM-9) 150 ml 150 ml 150 ml

Laboratorio Regionale Campioni Emilia-Romagna EMR 0001 EMR 0002 EMR 0003 EMR 0004 I dischetti sono stati inseriti ognuno in una provetta etichettata Friuli-Venezia Giulia Lazio Liguria Lombardia MI

21 Laboratorio Regionale Campioni Emilia-Romagna EMR 0001 EMR 0002 EMR 0003 EMR 0004 I dischetti sono stati inseriti ognuno in una provetta etichettata Friuli-Venezia Giulia Lazio Liguria Lombardia MI Lombardia PV Marche Piemonte Puglia Sicilia Veneto FVG 0001 LAZ 0001 LIG 0001 LMI 0001 LPV 0001 MRC 0001 PMT 0001 PUG 0001 SIC 0001 VEN 0001 FVG 0002 LAZ 0002 LIG 0002 LMI 0002 LPV 0002 MRC 0002 PMT 0002 PUG 0002 SIC 0002 VEN 0002 FVG 0003 LAZ 0003 LIG 0003 LMI 0003 LPV 0003 MRC 0003 PMT 0003 PUG 0003 SIC 0003 VEN 0003 FVG 0004 LAZ 0004 LIG 0004 LMI 0004 LPV 0004 MRC 0004 PMT 0004 PUG 0004 SIC 0004 VEN 0004

22 È stato assegnato un codice ad ciascun laboratorio LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO N. LRR01 LRR02 LRR03 LRR04 LRR05 LRR06 LRR07 LRR08 LRR09 LRR10

23 Spedizione del pannello

24 Contenuto del pacco: - 2 serie identiche di provette - le istruzioni per la manipolazione e il trattamento dei campioni

25 Istruzioni

27 FORMAT PER IL PT MOLECOLARE Informazioni generali

28 FORMAT PER IL PT MOLECOLARE Informazioni saggio di diagnosi molecolare

29 FORMAT PER IL PT MOLECOLARE Informazioni saggio per la genotipizzazione e risultati

30 Valutazione dei risultati

32 CRITERI DI VALUTAZIONE Tempestività: Trasmissione del report entro 30 giorni dal ricevimento del pannello Completezza delle informazioni relative alle metodiche utilizzate Risultati del saggio di diagnosi molecolare Individuazione dei genotipi Concordanza delle sequenze con quelle dei ceppi originali

33 TEMPESTIVITA NELLA RISPOSTA Entro 15 giorni Oltre 15 giorni 4/10 6/10 Tutti i laboratori hanno risposto entro 30 giorni

34 PERCENTUALI DI CONCORDANZA: RISULTATI DIAGNOSI MOLECOLARE LRR01 100% LRR02 100% LRR03 100% LRR04 100% LRR05 100% LRR06 100% LRR07 100% LRR08 100% LRR09 100% LRR10 100%

35 PERCENTUALI DI CONCORDANZA: IDENTIFICAZIONE DEL GENOTIPO LRR01 100% LRR02 100% LRR04 100% LRR05 100% LRR06 100% LRR07 100% LRR08 100% LRR09 100% LRR10 100%

36 ALLINEAMENTO SEQUENZE B3

37 ALLINEAMENTO SEQUENZE D8

38 ALLINEAMENTO SEQUENZE D9

39 PERCENTUALI DI CONCORDANZA: IDENTITA DELLE SEQUENZE LRR01 100% LRR02 94% LRR04 90% LRR05 100% LRR06 100% LRR07 100% LRR08 100% LRR09 99% LRR10 100%

40 CONCLUDENDO Tutti i laboratori hanno trasmesso il format con i risultati entro i termini richiesti Tutti i laboratori hanno ottenuto il risultato del 100% sui saggi di diagnosi molecolare Tutti i laboratori hanno ottenuto il risultato del 100% sull individuazione dei genotipi Concordanza delle sequenze con quelle dei ceppi originali inviati: - 6 laboratori su 9 hanno ottenuto il risultato del 100% - 1 laboratorio su 9 ha ottenuto il risultato del 99% - 2 laboratori hanno ottenuto un risultato tra il 90 e il 95%

41 MoRoNet: la Rete Nazionale di Laboratori di Riferimento per il Morbillo e la Rosolia Fabio Magurano Melissa Baggieri Antonella Marchi Paola Bucci Francesca Mazzilli Loredana Nicoletti

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