Dr.ssa Simona Grotta U.O.S.D. di Genetica Medica Ospedale San Pietro FBF Roma

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1 Impiego di un Sistema Automatico di Estrazione in Diagnosi Prenatale Dr.ssa Simona Grotta U.O.S.D. di Genetica Medica Ospedale San Pietro FBF Roma 1

2 SOMMARIO della presentazione Estrazione del DNA genomico Evoluzione delle tecniche di estrazione Estrazione manuale La nostra esperienza con un estrattore automatico Applicazioni diagnostiche Risultati e commenti Conclusioni 2 2

3 Estrazione del DNA genomico L estrazione degli acidi nucleici è la prima tappa nelle analisi di genetica molecolare. Una buona qualità dell'estrazione è fondamentale per garantire un buon risultato delle applicazioni. Esistono diversi metodi di estrazione e la scelta più adatta dipende da vari fattori: Campione Acido nucleico da estrarre Applicazione post-estrazione Numero di campioni Risorse 3

4 Evoluzione delle tecniche di estrazione Fenolo/Cloroformio Salting Out Membrane in silice Biglie magnetiche ESTRATTORI AUTOMATICI 4

5 Estrazione manuale: membrana di silice Per 12 campioni Tempo totale estrazione: 45 (con presenza costante dell operatore) 5

6 La nostra esperienza: Sistema automatico Introdotto nel nostro Laboratorio da circa due anni per l estrazione degli acidi nucleici Capacità di processamento: 1-12 campioni Tempo corsa (LA, CVS, SP): circa 45-50' Tempo operatore: 5-10 Materiale di partenza: qualsiasi campione biologico 6

7 Fasi dell estrazione Lisi cellulare Aggiunta di biglie Lavaggi Eluizione del DNA nel tampone 7

8 Kit di estrazione I kit impiegati comprendono tutto il consumabile necessario per l estrazione Sono forniti in una gamma completa per le seguenti applicazioni: DNA da sangue Sangue periferico in EDTA Liquido amniotico Villi coriali Materiale abortivo Cellule in coltura Cellule fissate DNA da compioni forensi 8

9 Estrazione da Sangue Periferico Permette di estrarre DNA genomico da sangue intero (EDTA, Eparina, Citrato), cellule del sangue e buffy coat VOLUME DI CAMPIONE PROCESSABILE: µl VOLUME DI ELUIZIONE: µl RESA DA 200 µl DI CAMPIONE: 4-10 µg A 260/280: 1,8 A 260/230: 2,0 50 9

10 Applicazioni diagnostiche da SP MLPA e MS-MLPA Kit commerciali per FC, FRAXA, CX26-30 Studio di microsatelliti per UPD Sequenziamento Sanger acgh 60K 180K Real time-pcr VASTA APPLICABILITA E BUONI RISULTATI 10

11 Risultati da SP: MLPA DMD P034 DMD P035 11

12 Risultati da SP: MS-MLPA NUMERO DI COPIE METILAZIONE 12

13 Risultati da SP: Sequenziamento Sanger SEQUENZA PARZIALE DEL GENE CX26 13

14 Risultati da SP: acgh Oligo array 180K 14

15 Estrazione in campo Prenatale Il kit permette di estrarre DNA genomico da tracce biologiche o da campioni poveri di cellule LA, CVS, materiale abortivo, colture cellulari e fissati VOLUME DI ELUIZIONE: µl Pre-trattamento specifico per tipo di campione LISI ESTERNA 10 a max velocità 10 a 56 C 20 µl PK 200 µl Lysis Buffer 37 15

16 Resa dell estratto da Liquido Amniotico Settimana di gestazione in cui viene fatta l amniocentesi Quantità di LA prelevato 2 ml ~ 6 ng/µl A260/280: 1,6 A260/230: 0,5 10 ml ~ 25 ng/µl A260/280: 1,7 A260/230: 0,9 16

17 Resa dell estratto da Villi Coriali Quantità di frustoli prelevati 2mg ~ 20 ng/µl A260/280: 1,8 A260/230: 2,0 5 mg ~ 70 ng/µl A260/280: 1,8 A260/230: 2,0 17

18 Applicazioni diagnostiche: Prenatale QF- PCR Prenatal Bob s MLPA E MS-MLPA Kit commerciali per FC, FRAXA,CX2630 Studio di microsatelliti per UPD acgh 15K 60K 180K Real-Time PCR Sequenziamento Sanger 18

19 Risultati da Prenatale: QF-PCR LIQUIDO AMNIOTICO: 2 ml 19

20 Risultati da Prenatale: MLPA 9 ml 25 ng/µl 5 ml 10 ng/µl 2 ml 6 ng/µl 20

21 Risultati: Prenatal Bob s ELUIZIONE IN TRIS-HCl ELUIZIONE IN H2O 21

22 Risultati da Prenatale: acgh LIQUIDO AMNIOTICO 10ml Oligo array 60K Oligo array 15K 22

23 Conclusioni d Il Sistema ha trovato una particolare applicazione nel nostro laboratorio per le seguenti caratteristiche: Riduzione dell operatività manuale ed ottimizzazione dei tempi Maggiore praticità e rapidità del processo Selezione veloce dei protocolli e del caricamento Riduzione del rischio di contaminazione Riduzione di errori da parte dell operatore Flessibilità d uso ed eliminazione degli sprechi Qualità dell estratto equivalente o superiore ai sistemi manuali Vasto impiego nelle applicazioni diagnostiche Diminuzione dei costi complessivi rispetto ai kit manuali Ottima assistenza tecnica 23

24 Il Sistema in uso nel nostro laboratorio è: MagPurix 12s System della Zinexts, commercializzato in Italia dalla Resnova 24

25 Grazie per l attenzione d 25