5- Estrazione ed analisi di DNA

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1 5- Estrazione ed analisi di DNA Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU) 16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11)

2 La struttura del DNA

3 La traduzione dell informazione in proteina

4 Estrazione di acidi nucleici Isolamento di DNA o RNA da tessuto o da cellule eucariotiche o procariotiche o da compartimenti cellulari in cui essi sono presenti Varie fonti: Tessuti animali Tessuti vegetali Eucarioti o procarioti Virus Mitocondri o cloroplasti Liquidi biologici

5 Fasi dell estrazione di acidi nucleici Tutte le metodiche per l estrazione di acidi nucleici utilizzano 3 fasi: 1. Una lisi cellulare (spesso combinata con l inattivazione delle nucleasi cellulari) 2. La deproteinizzazione del campione lisato 3. La precipitazione dell acido nucleico

6 Rottura delle cellule Rompere la parete o la membrana cellulare Metodi meccanici: Omogeneizzatore Vibrazioni ultrasoniche Metodi non meccanici: Congelamento/scongelamento Shock osmotico Agenti litici Dopo la rottura della membrana plasmatica si otterrà una miscela complessa costituita da varie componenti cellulari come: DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi, proteine e sali

7 Deproteinizzazione La rimozione delle proteine dal lisato cellulare è una tappa importante perché: tra le proteine sono presenti enzimi capaci di degradare gli acidi nucleici, la presenza di proteine capaci di legarsi agli acidi nucleici impedendone la funzione e/o la purificazione. Sistemi di deproteinizzazione Cloroformio-alcool isoamilico: Le proteine formano un gel all interfase cloroformio-acqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione Sodio dodecil Solfato SDS: detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura secondaria Enzimi proteolitici es PROTEINASI K: una endopeptidasi aspecifica molto attiva

8 Precipitazione degli acidi nucleici La fase finale è la precipitazione in alcooli La preparazione è miscelata con 2 volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti (acetato di sodio, acetato di ammonio, soldio cloruro) e viene favorita dal freddo (-20 C). La precipitazione è dipendente dal raggiungimento di una massa critica Dopo precipitazione l acido nucleico può essere lavato con 70% di etanolo per rimuovere l eccesso di sali e risospeso in un tampone a bassa forza ionica per le successive analisi.

9 Come determinare la concentrazione di acido nucleico estratto mediante assorbanza La purezza e la concentrazione del acido nucleico estratto può essere calcolata mediante letture spettrofotometriche a 260 nm 1 OD = 50 μg/ml di DNA 1 OD = 40 μg/ml di RNA Il rapporto tra le OD misurate a 260 nm e 280 nm fornisce una indicazione della purezza dell acido nucleico esaminato Una soluzione di DNA o RNA puro dovrebbe avere un rapporto A260/A280 di 1,8 e 2,0 rispettivamente

10 Elettroforesi di DNA su gel di agarosio

11 Principio di separazione Consente di separare molecole cariche grazie all applicazione di un campo elettrico Il DNA, carico ( ) a ph neutro, migra verso il polo positivo (anodo)

12 Fattori che influenzano la velocità di migrazione del DNA sul gel Dimensione della molecola di DNA La velocità di migrazione è inversamente proporzionale al log 10 bp Concentrazione dell agarosio Esiste una relazione lineare tra la concentrazione del gel e logaritmo della mobilità elettroforetica Usando gel di conc. differenti è possibile separare una vasta gamma di molecole di DNA Conc. di agarosio Range di separazione (%) (Kb)

13 Concentrazione di agarosio D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattoso L agarosio è un polimero lineare che forma una matrice semisolida avente pori di dimensione diversa in funzione della concentrazione utilizzata La sua concentrazione determina il potere risolutivo del gel

14 Fattori che influenzano la velocità di migrazione del DNA sul gel Conformazione del DNA Il DNA plasmidico puo trovarsi in forma superavvolta, parzialmente denaturata, o lineare. Le 3 forme, a parità di dimensioni, migrano con velocità diverse Voltaggio La velocità di migrazione è proporzionale al voltaggio applicato. Per avere ottima risoluzione il gel deve essere sottoposto ad un voltaggio 5V/cm Composizione del tampone di corsa La presenza di ioni in soluzione permette la conducibilità elettrica e quindi la mobilità elettroforetica del DNA. Soluzioni tampone contengono EDTA (1-2 mm) ph 8, Tris-borato(TBE)/Tris-acetato(TAE), 50 mm. L agarosio viene sciolto nello stesso tampone di corsa Loading buffer 6x 0.25 % blue di bromofenolo (migra alla stessa vel. di un frammento di 300 bp) 0.25% xilene cianolo (migra alla stessa vel. di un frammento di 4000 bp) 30% glicerolo Bande corrispondenti ai frammenti di DNA si visualizzano utilizzando es. Gel Red un colorante fluorescente che si intercala alle basi del DNA e può essere rivelato attraverso luce UV.

15 Il GEL RED un colorante fluorescente Colorante fluorescente (intercalante) che consente di visualizzare il DNA Assorbimento a 280 nm (U.V.) ed emissione nel visibile (600 nm) Ha sostituito l etidio bromuro

16 Preparazione del gel di agarosio Pesare la quantità desiderata di agaroso e scioglierla in un volume adatto di tampone Bollire, aggiungere Gel red e versare nell apposito apparato per la corsa elettroforetica Avvenuta la corsa, illuminare il gel con raggi UV per rendere visibile il DNA Caricare la reazione alla quale sia stato aggiunto un colorante, in uno dei pozzetti del gel d agarosio e far avvenire la corsa elettroforetica fornendo energia elettrica.

17 Caricamento del gel I campioni di DNA vengono miscelati ad un colorante con funzione di addensante ed indicatore del fronte elettroforetico

18 Marcatore di dimensioni 1 kb DNA Ladder Marcatore di dimensioni: È costituito da frammenti di DNA aventi dimensioni note e consente di determinare la dimensione del DNA campione Viene fatto migrare insieme ai campioni di DNA come riferimento dimensionale

19 Analisi di DNA genomico