Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno).

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1 Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Programma: Giorno 1Preparazione di DNA genomico da foglie 2 - Controllo qualità DNA genomico e marcatori SSR 3 - Elettroforesi per SSR e preparazione marcatori Kaspar 4 Mappe di linkage Ora Attività Macinazioni tessuti Macinazione con N-liquido Estrazione DNA con kit Estrazione DNA con solventi Controllo qualità e quantità DNA genomico tramite elettroforesi e spettrofotometro Illustrazione protocollo marcatori SSR Assemblaggio reagenti e programmazione termociclatore Preparazione elettroforesi per SSR Illustrazione protocollo marcatori kaspar Assemblaggio reagenti e programmazione termociclatore Verifica risultato marcatore kaspar Prova pratica utilizzo software per mappe di linkage Protocolli consegnati: 1. Estrazione DNA genomico da foglia con Azoto liquido e CTAB 2. PCR per marcatori SSR 3. Elettroforesi per marcatori SSR 4. PCR per marcatori kaspar 5. Verifica risultato marcatore kaspar e utilizzo software per mappe di linkage

2 Estrazione DNA genomico da foglia con Azoto liquido e CTAB L estrazione del DNA da tessuti vegetali può risultare assai diversa a seconda del materiale di partenza utilizzato. In generale si basa sempre su una rottura meccanica della membrana cellulare che consente l accesso al materiale nucleare senza però degradarne il contenuto. Per questo è generalmente utilizzato una macinatura con azoto liquido per rompere la parete cellulare e consentire l accesso al DNA mantenendo la maggior parte degli enzimi cellulari inattivi. Una volta che i tessuti sono sufficientemente macinati può essere risospeso in un buffer di lisi cellulare come il CTAB. Successivamente, la maggior parte dei protocolli di estrazione prevede un passaggio in fenolo o fenolo:cloroformio per purificare il DNA dalla componente proteica che si solubilizza nella fase organica mentre il DNA rimane nella fase acquosa. Il DNA viene successivamente precipitato dalla fase acquosa mediante isopropanolo e lavato in etanolo per rimuovere sali di contaminazione. Il DNA purificato è poi risospeso in acqua (o TE 0,1 se necessario conservarlo per periodo più a lungo). Per verificare la qualità del materiale estratto si può utilizzare un gel di agarosio. 1. Preparare tubi falcon da 50 ml. 2. Macinare 6-9 g di tessuto fogliare fresco con azoto liquido e porlo nel tubo falcon facendo attenzione che tutto l azoto sia ben evaporato. 3. Aggiungere 20 ml di CTAB. 4. Mettere i campioni in stufa o bagno termostatico a 65 C per circa 90 minuti, agitare ogni 15 minuti. 5. Una volta raggiunta la temperatura ambiente aggiungere ugual volume di cloroformio e mescolare per inversione. 6. Centrifugare a 2000 g (3400 rpm) per 10 minuti. 7. Trasferire la fase superiore in un nuovo falcon da 50 ml. 8. Ripetere i passaggi per una migliore qualità del DNA. 9. Aggiungere ugual volume di isopropanolo. Mescolare per inversione alcuni minuti per far floculare il DNA. 10. Prelevare il floculo con un ansa sterile e porlo in un eppendorf da 2 ml e aggiungere 1,5 ml di Etanolo 70% e lasciare a 4 per almeno 1 ora o over-night. 11. Prelevare il DNA e risospendere in TE 0,1 (1-2 ml a seconda della grandezza della grandezza della nuvola). 12. Si conserva in freezer a Se al punto 10 non è visibile un floculo centrifugare a 2000 g per 15 minuti, svuotare il liquido per inversione e aggiungere 3 ml di Etanolo 70%. Lasciare over-night. Centrifugare a 2000g per 10 minuti e rimuovere l etanolo per inversione dei tubi. Asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o over-night. Risospendere il pellet in ml di TE 0.1 e trasferirlo in eppendorf. C-TAB 600 ml solution dh2o TRIS 1M ph 7.5 NaCl 5M EDTA 0.5M ph 8 CTAB TE 0.1X 50 ml solution 440 ml 60 ml 84 ml 12 ml 6g dh2o TRIS 1M ph 8 EDTA 0.5M 49.5 ml 500 µl 10 µl ATTENZIONE: Solventi organici come il cloroformio devono essere utilizzati sotto cappa e maneggiati con guanti di protezione.

3 Estrazione DNA genomico da foglia con DNeasy Plant Mini Kit

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7 Controllo qualità e quantità DNA genomico tramite elettroforesi e spettrofotometro Caricare il DNA estratto in un gel di agarosio 1% ATTENZIONE: Il gel contiene Bromuro di Etidio, sostanza mutagena che può indurre effetti carcinogenici. Maneggiare con guanti e occhiali di protezione sia il gel sia le vaschette di corsa elettroforetica. Caricare i seguenti campioni in pozzetti separati 5 μl 100 bp ladder λ DNA 5 ng/ μl 2 μl (10 ng DNA) λ DNA 5 ng/ μl 10 μl (50 ng DNA) λ DNA 10 ng/ μl 10 μl (100 ng DNA) 5 μl DNA sample + 5 μl acqua + 2 μl 6x Loading Buffer preparato su parafilm Correre il gel per 30 min at 100 V Esporre il gel alla luce UV e fotografarlo La presenza di una banda ad alto peso molecolare indica DNA di buona qualità, la presenza di una scia di bande a diversi pesi molecolari indica DNA degradato. La concentrazione del DNA estratta può essere stimata anche utilizzando uno spettrofotometro che stima la concentrazione del DNA sulla base dell assorbanza a 260 (tipica degli acidi nucleici) e la purezza sulla base del rapporto 260/280 (proteine) e 260/230 (zuccheri). Più comunemente nei laboratori e presente un biofotometro cioè uno spettrofotometro semplificato in cui il parametro lunghezze d'onda viene automaticamente impostato con la scelta del metodo. Tale metodo non consente però di verificare la qualità del DNA estratto poiché anche DNA degradato è considerato nella stima della concentrazione che spesso risulta quindi sovrastimata. L assorbanza di 1 OD è equivalente a circa 50 μg/ml concentrazione del DNA (μg/ml) = A260 x 50 μg/ml x il fattore di diluizione

8 esempio di DNA genomico non degradato (prima riga) e in parte degradato (seconda riga) che si presenta come una striscia di frammenti a diversi pesi molecolari. esempio di DNA genomico altamente degradato in cui è comunque ancora presente una quantità di DNA ad alto peso molecolare.

9 AMPLIFICAZIONE PCR per SSR - Diluire il DNA genomico alla concentrazione di 20 ng/µl (esempio: se la concentrazione stimata al biofotometro fosse di 300 ng/µl (Ci) e volessi preparare 30 µl di soluzione finale (Cf) si applica la formula Ci x Vi = Cf x Vf quindi 300 x Vi = 20 x 30 dove Vi = (20 x 30) /300 = 2 quindi metterò 2 µl del mio campione iniziale a 300 ng/µl in 28 µl di acqua) - Preparare la mix (n campioni + 1 ogni 10 campioni): [ ] iniziale H2O PCR Reaction buffer Magnesium chloride dntp Primer forward Primer reverce Taq polymerase DNA TOTALE H2O [ ] finale Vx1 a volume finale 5X 1X 25 mm 2 mm 25 mm each 0.2 mm 10 µm (10 pmol/µl) 0.5 µm 10 µm (10 pmol/µl) 0.5 µm 0.3 U 5 U/µl 100 ng 20 ng/µl 20 Ci Cf [ ] iniziale [ ] finale a volume finale PCR Reaction buffer 5 X Magnesium chloride 25 mm dntp 25 mm each Primer forward 10 µm (10 pmol/µl) Primer reverce 10 µm (10 pmol/µl) Taq polymerase 5 U/µl DNA 20 ng/µl TOTALE Vx1 20-(4+1,6+0, ,06+5) 7,18 Vx5 campioni 35,9 1X 2 mm 0.2 mm 0.5 µm (1*20)/15 (2*20)/25 (0.2*20)/25 (0,5*20)/10 4 1,6 0, , µm (0,5*20)/ U 100 ng 0,3/5 100/20 0,06 5 Vf 20 0, Ci x Vi = Cf x Vf Vi = Cf x Vf /Ci - Aliquotare 5 µl di DNA gnomico diluito in ciascuna eppendorf da 0.2 ml - Aggiungere 15 µl di master mix per eppendorf - V x 5 campioni PCR: programma amplificazione:

10 Cicli T ciclo Primer Concentrazione stock Concentrazione finale 100 M (100 pmol/µl) 10 µm (10pmol/µl) µl stock 10 Durata 3 30 s s TE 0.1X 90 µl Preparare le soluzioni stock (100 µm ovvero 100 pmol/µl) in TE 0,1 e conservarle a 20 C Le successive diluizioni vanno conservate a 4 C e rifatte ogni giorni. PCR reaction buffer Utilizzare sempre il buffer fornito con la Taq Polimerasi che si sta utilizzando Conservarlo a 20 C MgCl2 Viene, in genere venduto insieme alla TAQ e nel caso della PROMEGA alla concentrazione di 25 mm (stock solution) Si utilizza alla concentrazione finale di 0,5-4 mm Conservare a 20 C. e vortexare prima di usare (il magnesio tende a precipitare). I dntps legano il magnesio; se si varia la concentrazione di dntps, la concentrazione di Mg++ va compensata. Eccesso di Mg++: accumulo di prodotti aspecifici. Carenza di Mg++: riduzione della resa (il Mg++ e' il cofattore della Taq Polimerasi). DNTPs Vengono, in genere venduti singolarmente (datp, dctp, dgtp, dttp) alla concentrazione 100mM (stock solution) Si preparara una miscela contenente una ugual dose di ciascun nucleotide. Conservare a 20 C H2O Utilizzare acqua MilliQ autoclavata e monodose

11 ELETTROFORESI PER MARCATORI SSR Preparare gli appositi supporti inserendo un pettine da 15 pozzetti Preparare un gel di agarosio 2% sciogliendo 1 g di agarosio in 50 ml di TBE 0,5x utilizzando un forno a micronde. Lasciare raffreddare alcuni minuti ed aggiungere 1 μl di etidio bromuro mescolando dolcemente. ATTENZIONE: Il Bromuro di Etidio è una sostanza mutagena che può indurre effetti carcinogenici. Maneggiare con guanti e occhiali di protezione sia il gel sia le vaschette di corsa elettroforetica. Versare il gel e lasciare raffreddare per ca. 30 minuti Caricare i campioni e uno standard di riferimento (5 μl) 100 bp ladder Correre il gel per ca. 1 h Esporre il gel alla luce UV per visualizzare le bande Stima della concentrazione di agarosio: Più alta è la concentrazione di agarosio, più è piccolo il frammento di DNA che può essere visualizzato. I polimeri del gel agiscono infatti come una maglia e più è alta la concentrazione del gel più piccoli sono i pori della matrice e più è difficile per frammenti lunghi di DNA muoversi attraverso di essa. C è comunque un limite per la separazione accurata delle molecole di DNA mediante elettroforesi come riportato nella tabella che segue. Per stimare il peso di un frammento di DNA e stimare le condizioni di elettroforesi ottimali è comunque sempre opportuno inserire anche un marcatore di peso molecolare (es 100 bp DNA Ladder) assieme ai campioni. Grazie alla presenza dei gruppi fosfato (PO43-) il DNA è carico negativamente e migrerà quindi verso il polo positivo. Resolution of Linear DNA on Agarose Gels Recommended % Agarose Optimum Resolution for Linear DNA 0.5 1,000 30,000bp ,000bp ,000bp ,000bp ,000bp Minima quantità di DNA rilevabile come banda singola tramite fotografia di un gel colorato con Etidio Bromuro: 5 ng (1-10 ng) in un pozzetto largo 4,5 mm. Massima quantità di DNA separabile come banda singola senza effetti di "striscio" o "trascinamento": 200 ng in un pozzetto largo 4,5 mm. Voltaggio massimo al quale si mantiene la proporzionalità inversa tra peso molecolare e mobilità (log10): 5 volts/cm. (lunghezza del gel).

12 KASP genotyping technology Questo tipo di marcatori (KBiosciences Competitive AlleleSpecific PCR SNP genotyping system; KASPar) è un tipo di marcatore per l identificazione di SNP o indel in una sequenza genomica. Si tratta quindi di una PCR allele specifica. La chimica alla base della tecnica kaspar può essere definita FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Generalmente in queste tecniche la sonda è costituita da due fluorofori uno detto quencher (Q) che riduce la fluorescenza del reporter (R). Quando i due fluorofori non sono più in contatto si ha emissione di fluorescenza alla lunghezza d onda del reporter. La master mix di PCR comprende la probe e la mix Probe: Comprende 2 primer forward fluorescenti allele specifici (FAM e VIC) legati ad una sequenza di 18 bp (tail) due oligo complementari ai primer forward marcati legati ad un quencer che inizialmente ibridizzano ai primer forward marcati annullando il segnale. 2 primer forward allele specifici non marcati legati ad una sequenza di 18 bp (tail) 1 primer reverce comune non marcato. MIX: Nella miscela di PCR viene inoltre fornita una Taq DNA polimerasi che non è in grado di estendere primer che al 3 non siano perfettamente appaiati. La mix di PCR è composta da Buffer, Mg, dntp ed un dye standard interno (Rhodamine X, (Rox)) per normalizzare il segnale di fluorescenza dello strumento. Maggiori informazioni possono essere trovate nel sito:

13 - Diluire il DNA genomico alla concentrazione di 10 ng/ul - Preparare la mix (n campioni + 1 ogni 10 campioni): [ ] iniziale H2O Reaction mix 2X [ ] finale Vx1 V x 5 campioni a volume finale 1X containing ROX as a passive reference Primer (Assay mix) DNA TOTALE ng/µl 15 ng 15 - Aliquotare 1.5 µl di DNA genomico in piastre da 96 pozzetti - Aggiungere 13.5 µl di master mix per eppendorf - PCR: programma amplificazione: Cicli 1 T Durata s 1 Schema della piastra per lettura genotipi noti: A B C D E F G H 1 H2O P1 P2 F1 2 3 F1 4 F1 5 6 F1 P1 P2 F F1 11 F1 12 H2O P1 P2 F1 F1 H2O F1 H2O F1

14 La fluorescenza emessa dai campioni amplificati è letta ed analizzata trasferite apposito software (7000 system SDS software). La fluorescenza di ciascun campione è rappresentata in un asse cartesiano dove nell asse delle ascisse vi è la fluorescenza del fluorocromo VIC e nelle ordinate quella del fluorocromo FAM. E attesa una separazione di 3 nuvole di punti corrispondenti ai due omozigoti e all eterezigote nonché 4 campioni con emissione ridotta che corrispondono ai controlli in cui nella reazione PCR era stata messa acqua anziché DNA. Per poter assegnare con maggiore precisione il corretto genotipo ai diversi campioni è quindi importante avere numerosi controlli nella piastra di PCR. I quattro campioni controllo in cui la reazione di PCR è stata effettuata con acqua al posto del DNA sono rappresentati con un quadrato grigio e si collocano nella posizione attesa con fluorescenza significativamente inferiore rispetto a tutti gli altri campioni.

15 Ai campioni il cui genotipo era noto a priori prima della PCR e che erano stati inseriti solo come controlli è stato assegnato un valore corrispondente all allele X (gaspé), all ellele Y (B73) o all eterozigote. Poiché era atteso che la maggior parte dei campioni usati nella reazione di PCR fosse omozigote per uno dei due parentali, come controlli erano stati inseriti molti eterozigoti al fine di discriminare con precisione questa classe. A tutti i campioni viene assegnato un genotipo sulla base della loro fluorescenza permettendo così di distinguere le 3 classi genotipiche attese. Alcuni campioni, collocati in posizioni di difficile interpretazione, vengono lasciati indeterminati.

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