Progetto della classe II C

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1 Progetto della classe II C

2 Preparazione allo svolgimento dell esperienza La II C è preparata all esperienza presso il centro di ricerca E.B.R.I. iniziando un intenso lavoro di approfondimento sulla genetica che avrebbe fornito una preparazione adeguata alla prova sul campo.

3 L esperimento esamina l inserzione Alu nel locus PV9, specifico per l uomo ( in particolare, tipico di popolazioni caucache) e localizzato sul cromosoma 6. Vi sono due varianti con o senza Alu e quindi tre posbili genotipi nel locus PV9 : omozigoti+ +, eterozigoti+, omozigoti La determinazione del genotipo PV9 viene effettuata applicando la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction). Con questa tecnica, che amplifica milioni di volte uno specifico frammento di DNA genomico, riusciamo ad isolarlo dal suo contesto riuscendo così a distinguere gli alleli + e, differenti per grandezza, grazie all elettrofore su gel di agaroo.

4 Strumenti Micropipette diversamente graduate 3 provette da,5 ml Centrifuga Ghiaccio Elettrodi da 3 volt

5 Veramo ml di soluzione salina (,9% NaCl) in bocca e sciacquiamo vigorosamente per 3 secondi. Espelliamo la soluzione in un bicchiere di carta. Con un movimento circolare mescoliamo le cellule e trasferiamo ml del liquido in una provetta da.5ml.

6 Inseriamo la provetta in una microcentrifuga e centrifughiamo al masmo dei giri per minuto. A questo punto nella provettina troveremo un sopranatante e, sul fondo, il pellet di cellule. Dopo aver gettato il sopranatante, sospendiamo nuovamente le cellule pipettando su e giù.

7 Preleviamo 3ml di sospenone di cellule e le aggiungiamo al tubo contenente μl di Chelex(rena che viene diluita in acqua distillata al 5%). Dopo aver fatto bollire le cellule per circa minuti, raffreddiamo la provetta con del ghiaccio. Dopo aver centrifugato il tubo al masmo dei giri, trasferiamo 3μl di sopranatante (contente DNA) in una nuova provetta da.5ml. Con una micropipetta inseriamo in una provetta una miscela colorata, di caricamento (3,9% di saccaroo e,8% di rosso cresolo) e una pallina di PCR.

8 Con la masma velocità posbile, inseriamo il nostro DNA nella nuova provetta dove sta avvenendo la reazione per poi passare alla centrifugazione. Dopo la centrifugazione il rosso cresolo, il saccaroo e il DNA costituiscono una miscela colorata pronta per essere inserita nei pozzetti del blocco di gel di agaroo. Il primo pozzetto di ogni gel è stato destinato ad un marcatore di peso molecolare noto. Preleviamo μl dal tubo contente la reazione di PCR e lo carichiamo nel pozzetto assegnato di gel di agaroo al %. Eseguiamo così l elettrofore (tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche

9 immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso) a 3 volts per 4 minuti. Il gel di agaroo contiene una piccola quantità di bromuro di

10 etidio (EtBr) che, durante la corsa elettroforetica, lega al DNA colorandolo. Infatti il bromuro di etidio quando viene colpito da luce ultravioletta emette una fluorescenza vibile. L immagine viene poi catturata da una fotocamera digitale collegata al computer. L individuazione del genotipo sarà posbile in base al differente peso del DNA. Infatti quello contenente Alu PV9 sarà più pesante e quindi in pozione inferiore rispetto agli altri. Dalla nostra anali abbiamo ottenuto i seguenti risultati:

11 Reazione riuscita? Allele + (presenza di ALU nel locus PV9) Allele (Assenza di ALU nel locus PV9) Omozigote -/- Omozigote +/+ Eterozigote +/- e -/+ studente studente studente 3 studente 4 studente 5 studente 6 studente 7 studente 8 studente 9 studente studente studente studente 3 studente 4 studente 5 studente 6 studente 7 studente 8 studente 9 studente studente studente Totale studenti Totale Studenti con rezione riuscita Totale alleli + Totale alleli percentuale alleli + percentuale alleli - percentuale omozigoti -/- percentuale omozigoti +/ + percentuale eterozigoti +/- e -/+ 7% 73% 59% 4% 7% Studenti Totale Totale Totale omozigoti +/ eterozigoti -/ omozigoti -/+ + e +/- Note

12 Concluoni Gli elementi Alu sono presenti solo nei primati i quali sono una derivazione del ramo evolutivo scimmie che include anche gli umani. Così centinaia di migliaia di copie Alu sono accumulate nei primati quando questi sono separati dagli altri gruppi vertebrati 65 milioni di anni fa. Una volta che un Alu integra in un nuovo to esso accumula nuove mutazioni con la stessa frequenza del DNA che lo circonda. Tutti i primati che presentano un inserimento Alu in un luogo particolare devono averlo ereditato da un antenato comune. Questa è chiamata identità per discendenza. Alla fine dell esperienza abbiamo avuto modo di discutere con il responsabile dell attività dei nostri dubbi e curiotà inerenti all esperienza svolta.

13 Riconoscimenti ottenuti Dopo la nostra esperienza presso l E.B.R.I., in occaone di un interessantisma conferenza preeduta dal premio Nobel Rita Levi Montalcini, abbiamo ricevuto degli attestati di partecipazione.

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