Corso di: GESTIONE FAUNISTICA. Prof. Bernardino Ragni

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1 Corso di: GESTIONE FAUNISTICA Prof. Bernardino Ragni Università degli Studi di Perugia Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche Naturali Corso di laurea in Scienze Naturali LAUREA MAGISTRALE Caso di studio: Protocollo per l analisi genetica Relatore: PhD Francesca Vercillo 1

2 ANALISI GENETICA Il DNA può essere ottenuto da peli, penne, frammenti di pelli o da feci, successivamente amplificato, gli studi genetici, quindi, possono essere completati senza disturbare gli animali. Gli escrementi dei Carnivori sono caratterizzati dalla presenza di un sottile strato di muco intestinale che, anche dopo l'espulsione dell'escremento, riveste la parte esterna del deposito fecale, soprattutto quando è fresco. Pertanto il DNA viene ricercato all'interno delle cellule epiteliali intestinali che si prelevano raschiando delicatamente, con bisturi, la superficie esterna dell'escremento. Per evitare di prelevare anche il contenuto, che può essere dannoso per l'estrazione del DNA, è preferibile effettuare questa operazione quando l'escremento è ancora congelato. TESSUTO E PELO ESTRAZIONE Il DNA è stato estratto da muscolo (20 mg) e da pelo (circa 40 peli con bulbo) usando il Wizard-Genomic-DNAPurification Kit (Promega) (Vercillo et al., 2004). Per i campioni di pelo è stata necessaria una fase di pre-lisi a 4 C overnight con Nuclei Lysis Solution (Promega) seguito poi dal protocollo standard di estrazione della Promega riportato di seguito. Protocollo di estrazione: 1. Prelevare una parte di tessuto (20 mg) e passarla in un potter con 600 µl Nuclei Lysis Solution; dopo aver triturato bene il campione trasferite tutto in eppendorf da 1.5 ml e mettere in ghiaccio 2. Incubare il lisato a 65 C per 30 minuti 3. Aggiu ngere in ogni eppendorf 3 µl di RNAse Solution miscelando per inversione 2-5 volte 3. Incubare la miscela a 37 C per 30 minuti 4. Lasciare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti 5. Aggiungere 200 µl di Protein Precipitation Solution e vortexare immediatamente per 20 secondi 6. Lasciare i campioni in ghiaccio per 5 minuti 7. Centrifugare i campioni per 4 minuti a xg 8. Rimuovere il surnatante e trasferirlo in eppendorf 1.5 ml contenente 600 µl di isopropanolo 9. Miscelare gentilmente i campioni fino alla comparsa del DNA 2

3 10. Centrifugare per 1 minuto a xg (si formerà un pellet di DNA in fondo alla provetta) 11. Rimuovere il surnatante, aggiungere 600 µl di etanolo al 70% e miscelare delicatamente 12. Centrifugare per 1 minuto a xgCapitolo Aspirare delicatamente l etanolo e lasciare evaporare completamente (10-15 minuti) 14. Aggiungere 100 µl di DNA Rehydratation Solution 16. Incubare il DNA a 65 C per un ora o a 4 C overnight Lasciare il campione a temperatura ambiente per circa 15 minuti Conservare il campione a 20 C AMPLIFICAZIONE Partendo dal DNA estratto si procede con l'amplificazione mediante PCR, acronimo di Polymerase Chain Reation (Mullis e Faloona, 1987). Questa tecnica permette, in breve tempo, di amplificare una specifica sequenza di DNA, moltiplicandola in modo geometrico, fino a 10 8 volte, partendo da quantità iniziali molto esigue. La reazione avviene in un apposito apparecchio detto termociclatore o thermal cycler nel quale viene posizionata una provetta contenente una miscela di reazione, che consente la duplicazione del frammento di DNA che si vuole amplificare. Per il nostro studio si è scelto di amplificare una regione presente sull'elica leggera del DNA mitocondriale, il Citocromo b (Cytb), che come tutti i geni va incontro a mutazioni, ma rispetto ad altri è altamente conservato e consente il confronto genetico e la discriminazione tra specie. Il DNA mitocondriale (mtdna) è il materiale genetico presente nei mitocondri, gli organelli presenti in tutte le cellule degli organismi aerobi, contenenti gli enzimi necessari per la maggior parte delle reazioni ossidative, che producono l'energia fondamentale per le funzioni vitali. La struttura del mtdna è circolare e a doppia elica, con un'elica leggera (H) e un'elica pesante e super avvolta. Si differenzia dal DNA nucleare, per una minore quantità, maggiore resistenza e per il diverso contenuto in CG, per cui è possibile separarlo da esso, mediante centrifugazione all'equilibrio, su gradiente di densità in CsCl; inoltre non è associato ad istoni e l'eredità è uniparentale. Ciò significa che da una generazione a quella successiva, tutta la progenie possiede il fenotipo di un genitore soltanto. Negli eucarioti pluricellulari, il fenotipo espresso è quello materno. Si parla perciò di eredità materna, dovuta al fatto che la quantità di citoplasma della cellula uovo, supera di molto quella maschile, quindi lo zigote riceve la maggior parte del citoplasma e di tutti gli organelli citoplasmatici, con il loro DNA, dalla linea materna; in questo modo la variabilità genetica si riduce di ¼, (rendendo più facili gli studi sul DNA). Per amplificare un frammento di DNA di interesse devono essere identificate delle sequenze specifiche non varianti (conservate) per progettare primer per la reazione di PCR. Un primer (innesco) è una corta sequenza di nucleotidi 3

4 che si appaia con un filamento di DNA e fornisce una estremità libera dalla quale l'enzima DNA polimerasi inizia la sintesi di un filamento complementare di DNA. La miscela utilizzata per l'amplificazione contiene: DNA da amplificare; nucleotidi liberi dntp che rappresentano i mattoni con cui costruire i frammenti-copia; Taq DNA polimerasi, derivata da batteri termofili (Thermophilus acquaticus), che è termostabile e può sopportare le fasi di denaturazione del DNA a temperature molto alte (> 92 C); Primer, una per ciascun filamento, costituite da circa 20 oligonucleotidi sintetici, complementari alle sequenze fiancheggianti il segmento da amplificare; Tampone costituito da diverse sostanze chimiche che hanno la funzione di stabilizzare la reazione e facilitare l'attività della Taq polimerasi, senza danni per le sequenze di DNA (BSA, MgCl 2 NaCl ed altre). La reazione consiste in una prima fase di denaturazione termica della doppia elica, che avviene a C per 2-3 minuti, seguit a da circa cicli di denaturazione sempre a C, poi si passa alla t emperatura di annealing, che consente ai primer di legarsi alle sequenze fiancheggianti e successivo passaggio di estensione a 72 C, durante il quale la DNA polimerasi catalizza l'estensione dei primer, utilizzando come stampo, la sequenza da amplificare. Al termine dei cicli si ottengono, partendo da piccole quantità di DNA, numerose copie della sequenza target (White et al.,1989). I tempi di permanenza possono variare, ma sono comunque molto brevi, in genere pochi secondi. Protocollo di amplificazione: Lo studio dei primer è stato eseguito sulle sequenze registrate nella banca dati del NCBI (martora AF e faina AJ441336). I primer così ottenuti sono: Martes181 (5 -CAGCCTTCTCATCAGTCACC-3 ) e Martes399 (5 -CAGAACGTAACCTATGAATGC-3 ), che hanno permesso di amplificare un frammento di 218-bp Cytb. L amplificato da PCR ha prodotto un volume totale di 25 µl, ottenuto con 3 µl di DNA, 20 µl di acqua sterile deionizzata e 1 µl per ciascun primer (2.5mM) in puretaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences). Il programma della PCR consiste in 2 minuti a 94 C, seguito da 30 cicli con 30 secondi a 94 C, 15 secondi a 55 C, 1 minuto a 72 C e in fine 10 minuti a 72 C. 4

5 RESTRIZIONE Il mtdna amplificato è poi analizzato mediante marcatori molecolari detti RLFP o Restriction Fragment Lenght Polymorphism 1. I marcatori molecolari sono frammenti di DNA presenti in un unico punto del genoma, che consentono di analizzare la variabilità e di distinguere, fra loro, genotipi anche molto simili, fornendo una vera e propria impronta digitale del DNA detta fingerprinting, caratteristica di ogni individuo. Tali enzimi riconoscono corte sequenze nucleotidiche (4-8 paia di basi), spesso palindromiche, e tagliano la doppia elica in corrispondenza di tali sequenze detti siti specifici o siti di restrizione. In seguito alla digestione di un genoma completo o parti di esso, si generano dei frammenti di diversa lunghezza, separabili in base al loro peso molecolare mediante corsa elettroforetica in gel d'agarosio, noti come frammenti di restrizione. Il confronto diretto tra le differenti porzioni di taglio, in soggetti diversi, permette di individuare polimorfismi utili per l'analisi delle relazioni genetiche inter- e intraspecifiche. Per escludere che i tagli ottenuti siano frutto di semplice variabilità individuale, si possono usare due enzimi di restrizione e osservare i frammenti che si ottengono, se si ha lo stesso risultato, si può escludere che si tratti variabilità individuale e affermare, invece, che sia una variabilità legata alla specie. Protocollo di restrizione: La restrizione è stata ottenuta con 3 ore di incubazione a + 37 C per ciascun campione, composto da 10 µl di frammento amplificato di Cytb, 0.5U di AluI, 1.5 µl di BufferC (Promega) e 3.5 µl di acqua sterile deionizzata per un volume totale di 15 µl. I frammenti digeriti con l enzima AluI sono stati sottoposti a corsa elettroforetica, simultaneamente ad un ladder DNA (GeneRulerTM 100bp DNA Ladder, Fermentas), in un gel d agarosio al 2.5% con l aggiunta di Bromuro d Etidio e poi osservati con lampada UV. Il Bromuro di Etidio si intercala tra le basi del DNA ed essendo eccitabile dalle radiazioni UV, rendendolo visibile. DEPOSITO FECALE ESTRAZIONE L'estrazione è stata realizzata utilizzando il Wizard-Genomic-DNA Purification Kit (Promega), con opportune modifiche (Lucentini et al., 2007). Si pongono i campioni di deposito fecale ottenuti come suddetto, in eppendolf da 1,5 ml. Vengono preparate tante eppendolf quanti sono i campioni da analizzare aggiungendo in ognuna di esse 500µl di Nulei Lysis Solution e 5

6 120µl di EDTA e poste in ghiaccio. Da queste si prelevano 600µl e si aggiungono alle eppendolf contenenti i campioni, precedentemente preparati. Per facilitare l'omogenizzazione, si utilizza un potter manuale e il lisato così ottenuto si pone in ghiaccio finché non diviene lattescente. A questo punto vengono aggiunti in ogni provetta 17,5µl di Proteina K e si incubano a bagnomaria a 55 C overnight. Protocollo di estrazione: 1. Preparare in una eppendolf da 1,5µl una miscela con 500µl di Nulei Lysis Solution e 120µl di EDTA e lasciare in ghiaccio. 2. Prelevare una piccola quantità (10 mg) della parte più superficiale del deposito fecale, porla in una eppendolf da 1,5µl e aggiungere 600µl della miscela precedente. 3. Rendere omogenea la miscela con un potter manuale e porre il lisato in ghiaccio. 4. Aggiungere 17,5µl di Proteina K 5. Incubare i campioni a 55 C overnight. 6. Aggiungere 5µl di RNAse Solution e miscelare per inversione 2-5 volte. 7. Incubare a 37 C per 30' e lasciare 5' a temperat ura ambiente. 8. Aggiungere µl di Protein Precipitation Solution e vortex per 20''. 9. Lasciare in ghiaccio per 6'. 10. Centrifugare per 4' a 13000xg e il trasferire il surnatante contenente DNA in una nuova eppendolf da 1,5µl contenente 600µl di isopropanolo. 11. Miscelare delicatamente le provette fino alla comparsa della matassa di DNA. 12. Centrifugare per 1' a 13000xg per far precipitare il DNA l'eliminare il surnatante, il recuperare del DNA estratto. 13. Lavare il materiale genetico con 600µl di EtOH 70%, miscelando lentamente 14. Centrifugazione per 1' a 13000xg. 15. Eliminare l'etoh svuotando la provetta e lasciando evaporare per 10-15'. 16. Risospendere in 30µl di DNA Rehydratation Solution 17. Incubare a 65 C per 20' e poi porlo a 4 C overnight. 18. Conservarlo a -20 C. 6

7 AMPLIFICAZIONE Protocollo di amplificazione: Il protocollo prevede come specie target non solo la martora (Martes martes) e faina (Martes foina) ma anche puzzola (Martes putorius) e volpe (Vulpes vulpes), che spesso presentano escrementi morfologicamente confondibili. Pertanto lo studio dei primer è stato eseguito sulle sequenze delle 4 specie, il cui DNA è stato estratto da campioni di tessuto o di pelo di animali certamente appartenenti alle specie di interesse (Vercillo et al., 2006). Sono state selezionate due coppie di primer: MM1 (5' ATGACCAACATTCGTAAAAC 3') MM3 (5' CAGAT(CT)TTGAATATGGAAGC 3') compatibile con martora, faina e puzzola che permettono di amplificare un frammento di 278 bp del Cytb; VULPES1 (5' ATGACCAACATTCGAAAGAC 3') VULPES2 (5' CTGCATGAAGAGGCAGATAA 3') compatibile con volpe che permettono di amplificare un frammento di 291 bp del Cytb. L'amplificato da PCR produce un volume totale di 25µl, ottenuto con 3µl di DNA, 20µl di acqua sterile deionizzata e 1µl di ciascun primer (2,5 mm) in puretaq Ready-To-Go PCR beads (Amersham Bioscences). Programma PCR per MM1-MM3 Il programma PCR per la coppia di primer MM1 e MM3 consiste in una fase iniziale di 3 minuti alla temperatura di 94 C, seg uita dalla ripetizione di 30 cicli, ciascuno dei quali costituito da : 30 secondi a 94 C ( fase di denaturazione del DNA) ; 20 secondi a 48 C ( fase di annealing); 45 secondi a 72 C ( fase di estensione del DNA). Terminato l'ultimo ciclo viene condotta una fase finale di estensione ad una temperatura di 72 C per una durata di 10 minuti. Per verificare se l'amplificazione è stata effettuata correttamente, vengono analizzati i prodotti della PCR. Per prima cosa si prepara il gel d'agarosio al 2%, vi si caricano i campioni e si procede con la corsa elettroforetica e successiva osservazione al transilluminatore. Se sono visibili le bande vuol dire che l'amplificazione è avvenuta e che il DNA sicuramente appartiene o a martora o a faina o a puzzola. Per l'attribuzione specifica si esegue la restrizione che restituiscono pattern specifici e consentono la discrminazione delle tre specie. Nel caso contrario, sicuramente il DNA non appartiene alle tre specie suddette e si tenta una nuova amplificazione, questa volta con primer specifici per volpe. A questo punto se l'amplificazione avviene si può 7

8 attribuire il campione a puzzola, in caso contrario può significare o che il campione non appartiene a nessuna delle quattro specie o che non compare o che l'estrazione non è stata effettuata correttamente a causa del cattivo stato conservativo dei depositi fecali. Programma PCR per VULPES1-VULPES2 Il programma PCR per la coppia di primers VULPES1 e VULPES2 consiste in una fase iniziale di 3 minuti alla temperatura di 94 C, seguita dalla ripetizione di 30 cicli, ciascuno dei quali costituito da : 30 secondi a 94 C ( fase di denaturazione del DNA) ; 1 minuto a 55 C ( fase di annealing); 1 minuto a 72 C ( fase di estensione del DNA). Terminato l'ultimo ciclo viene condotta una fase finale di estensione ad una temperatura di 72 C per una durata di 10 minuti. Nel caso in cui l'amplificazione con primer per martora, faina e puzzola danno risultati positivi, si prosegue con la determinazione della specie come descritto di seguito. RESTRIZIONE Protocollo di restrizione: La digestione del frammento amplificato con MM1 e MM2 è stata effettuata con due enzimi (AluI e MaeIII) che restituiscono, tramite la corsa elettroforetica pattern specie-specifici in grado di individuare con certezza la specie. La restrizione prevede l'incubazione dei campioni con gli enzimi di digestione per 3 ore a + 37 C. I campioni presentano un volume totale di 20µl e sono composti da 15µl di amplificato di Cytb, 0,5µl di enzima, 2µl di BufferC (Promega) e 2,5µl di acqua sterile deionizzata. I frammenti digeriti sono sottoposti a corsa elettroforetica, simultaneamente ad un ladder DNA( GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder, Fermentas), in un gel d' agarosio al 2,5% con l'aggiunta di Bromuro di Etidio (EtBr) e poi osservati al transilluminatore. 8