SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo

Transcript

1 C.R.A. Consiglio per la Ricerca in Agricoltura Centro di ricerca per la genomica Fiorenzuola d Arda (Piacenza) SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo Tutor: Dott. Gianni TACCONI Studente: Silva Denise Polo Scolastico Mattei- 4A Liceo Scientifico A.S,

2 GPG

3 La striatura bruna dell orzo La striatura bruna è una malattia biotrofica dell orzo ad eziologia fungina, causata dall ascomicete Pyrenophora graminea, diffusa praticamente ovunque si coltivi orzo. Fig. (A) Sintomi fogliari; (B) confronto tra 2 parcelle: quella di sinistra deriva da seme non conciato e mostra evidenti sintomi di striatura bruna.

4 Sistemi di difesa dalle malattie lotta chimica ( antiparassitari) Genetica ( geni di resistenza) L'impiego di varietà di orzo resistenti al patogeno è il metodo di difesa più economico e più ecocompatibile

5 Esperienza di laboratorio: Utilizzo di marcatori molecolari per la selezione assistita (MAS) per la resistenza a malattia fungina in orzo. I principali vantaggi della MAS sono: Possibilità di selezionare genotipi con un gene specifico ( geni di resistenza) possibilità di selezionare simultaneamente per più geni di resistenza a più patogeni. selezione per resistenza a patogeni evitando test di infezione; riduzione dei tempi necessari alla costituzione di nuove verietà.

6 I Marcatori Molecolari I marcatori molecolari sono sequenze identificabili di DNA che si trovano in specifiche regioni del genoma e che vengono trasmesse secondo le normali leggi di Mendel da una generazione all'altra. Si basano sulla rilevazione di differenze nella sequenza nucleotidica del DNA che costituisce il genoma di ogni individuo, diversamente dai marcatori morfologici, che si basano su caratteri osservabili, e da quelli biochimici, che si basano sulle proteine codificate dai geni. Ne esistono molti tipi diversi, differenti per molteplici aspetti, come la quantità di tempo, di risorse e di lavoro richiesti per la loro analisi, la ricorrenza nel genoma e la variabilità genetica in una data popolazione.

7 GENE di RESISTENZA Rdg1 MARCATORI CROMOSOMA 2HL

8 Raccolta del materiale vegetale Genotipi derivati da incrocio tra pianta Resistente (K4-31) e piante suscettibili ORZO A K B Sfera C FO K D Fior E FO K F Boreale G FO H Markers: tutte Yd3+Rdg1 Gene di resistenza: Rdg1

9

10 Analisi molecolare Estrazione del DNA da tessuto fogliare di orzo: Metodo kit Wizard Magnetic 96 DNA Plant System Il metodo si basa sull'uso del reagente MagneSil Paramagnetic Particles (PMPs), che lega gli acidi nucleici, permettendone poi di fare facilmente i lavaggi ed in fine un eluizione in acqua (in cui il DNA si risospende). Procedimento con Robot Biomek 2000 Il ricorso al Robot consente di eseguire in automatico buona parte della procedura di estrazione e purificazione del DNA.

11

12 Polimerase Chain Reaction (PCR). Ideata da Kary Mullis nell aprile 1983 (gli fruttò il premio Nobel per la chimica nel 1993), la PCR non è altro che la polimerizzazione del DNA effettuata in vitro e ripetuta per più volte, portando ad una amplificazione esponenziale della quantità di DNA sintetizzato a partire da una piccola quantità di DNA stampo ( template ). L enzima DNA-polimerasi sintetizza l elica di DNA complementare all elica stampo a partire da dei brevi tratti di DNA a singola elica (primers),appositamente disegnati, perciò basta ripetere più volte denaturazione, appaiamento dei primers ed estensione. L uso di polimerasi termostabili ha permesso di poter ripetere queste fasi più volte di seguito, in macchine dette temocycler, senza dover aggiungere, dopo ogni fase di denaturazione, nuova polimerasi (all inizio si usava la DNApolimerasi di E. coli). Gli step fondamentali della reazione di polimerizzazione sono : denaturazione della doppia elica ad alta temperatura (94 C); appaiamento dei primers alla temperature di appaiamento (temperature di annealing Ta); estensione dei primers a dare DNA a doppia elica (dsdna) alla temperature di lavoro della DNA polimerasi usata (generalmente si usa la Taq-polimerase che lavora a 72 C). 35 cicli di amplificazione: 2 35 =

13 Figura 3-8 Reazione a catena della polimerasi (fonte: Genetica di Russel)

14 Marcatori molecolari per il gene di resistenza marker type primer F/R Tm Ta enzyme FD CAPS TCTCTCATCTATGATATGATCCTAGC AflII CAACAGGATCAGAGAAACCATGC 65.6 GBM1462 SSR CTGTGGCTAAAGAAGGCACC CACGACGTTGTAAAACGACAAGATTGCTGCAGGATAGGC 62.0 Tm= ( C+G) x 4 C +(A+T) x 2 C Ta = Tm-5

15

16 Corsa elettroforetica su gel di agarosio. Poiché a ph alcalino il DNA è carico negativamente (dati i gruppi fosfato dei nucleotidi) si sfrutta la diversa velocità di migrazione elettroforetica attraverso le maglie del gel di agarosio in un campo elettrico. Aumentando la percentuale di agarosio si hanno maglie più fitte e quindi si separano meglio frammenti di dimensioni simili, cioè si aumenta il potere risolutivo del gel.

17 Fig. Genotipizzazione della popolazione F 2 FO 4941 per il gene Rdg2a con la sonda molecolare 146G20-1: il prodotto di PCR digerito ha evidenziato, su gel di agarosio, genotipi con frammenti di circa 270 bp (banda bassa), corrispondenti al controllo resistente (Cornelia), e frammenti di circa 300 bp (banda alta), corrispondenti al controllo suscettibile (Jaidor), oltre a genotipi eterozigoti.

18 Analisi di un intera piastra( 96 campioni)

19 Conclusioni Attraverso l analisi del DNA è possibile selezionare i genotipi resistenti ( MAS) È quindi possibile sviluppare nuove varietà di orzo resistenti in maniera più veloce