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1 Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo

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3 HUMAN GENOME PROJECT (HGP) 1990 DETERMINARE LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DELL INTERO GENOMA UMANO (~3,2 x 10 9 bp) COLLEZIONARE QUESTA INFORMAZIONE IN BANCHE DATI IDENTIFICARE TUTTI I GENI UMANI

4 HUMAN GENOME PROJECT (HGP) 1990 Pianificato per una durata di 15 anni Completato nel 2003 (prima bozza nel 2000)

5 Sequenziamento del DNA T C G A Didesossinucleotidi marcati fluorescenti A G T G C A T C A G T A T T G G Reazione di sequenza, separazione dei frammenti I frammenti fluorescenti passano attraverso il detector Metodo manuale Metodo automatizzato

6 METODO MANUALE METODO DI SANGER METODO DI MAXAM- GILBERT

7 METODO DI SANGER Metodo per terminazione di catena METODO DEI DIDEOSSI METODO ENZIMATICO Nella miscela di reazione i ddntps vengono mescolati, in bassa concentrazione, con i dntps: competizione. Quando un ddntp è incorporato nella catena nascente al posto di un dntp, ne impedisce l ulteriore allungamento.

8 Metodo di Sanger Dideossiribonucleotidi

9 METODO DI SANGER

10 Metodo di Sanger

11 Metodo di Sanger

12 ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE Per analizzare i prodotti finali delle reazioni è necessario utilizzare un gel ad altissima risoluzione poiché si devono separare frammenti di DNA che differiscono tra di loro per un solo nucleotide. Si tratta di un gel sottilissimo (0,3-0,4 mm) di acrilammide ed urea preparato tra due lastre di vetro di notevole lunghezza (circa 40 cm).

13 GEL DI SEQUENZA ALTO POTERE DI RISOLUZIONE CONDIZIONI DENATURANTI= UREA ALTO VOLTAGGIO = V TEMP. CONTROLLATA COSTANTE = C

14 Sequenziamento: metodo manuale T C G A 5 A T A A G G A C A C T T C A A T 3

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16 METODO DI MAXAM-GILBERT Degradazione chimica - METODO CHIMICO Permanganato di potassio = T Acido formico= A Dimetil solfato = G

17 METODO DI MAXAM-GILBERT Degradazione chimica - METODO CHIMICO Dimetil solfato = G MARCATURA metile G G G metile G G G metile G G G PIPERIDINA

18 METODO DI MAXAM-GILBERT Degradazione chimica - METODO CHIMICO MARCATURA PIPERIDINA G G G G G G

19 METODO DI MAXAM-GILBERT Degradazione chimica - METODO CHIMICO MARCATURA G G G

20 Sequenziamento: metodo manuale T C G A 5 A T A A G G A C A C T T C A A T 3

21 METODO CHIMICO MAXAM - GILBERT LABORIOSO REAGENTI TOSSICI METODO ENZIMATICO SANGER QUELLO + USATO CON MODIFICHE

22 BigDye technology IL CAMPIONE PUO ESSERE PROCESSATO IN UN UNICA PROVETTA

23 Sequenziamento a ciclo termico Necessità di minor quantità di stampo di DNA Annealing più specifico del primer Possibilità di sequenziare prodotti di PCR o stampi difficili (es. cosmidi)

24 SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO METODO SANGER MODIFICATO RODAMINA ACIDO AMINOBENZOICO FLUORESCEINA

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27 dntp Timina Adenina Guanina Citosina SANGER + ddntp marcati ddtimina ddadenina ddguanina ddcitosina Ogni ddntp è coniugato con un diverso fluorocromo.

28 SANGER IN AUTOMATICO Denaturazione del prodotto di PCR

29 SANGER IN AUTOMATICO Annealing del primer Primer 1

30 SANGER IN AUTOMATICO Estensione: la DNA polimerasi inizia l estensione del filamento a partire dall estremità 3 OH del primer in presenza di dntp S e ddntp S. Primer 1 DNA polimerasi

31 Estensione SANGER IN AUTOMATICO Primer 1 DNA polimerasi

32 SANGER IN AUTOMATICO Il filamento di DNA viene esteso fino a quando non viene incorporato un ddntp Primer 1 ddntp

33 SANGER IN AUTOMATICO Il filamento neosintetizzato viene rilasciato e lo stampo originale è pronto per essere copiato ddntp

34 SANGER IN AUTOMATICO Si ripete il processo : Denaturazione 95 Annealing Estensione CICLI Primer 1

35 SANGER IN AUTOMATICO La sintesi procede: grazie alla incorporazione casuale dei ddntps vengono sintetizzate centinaia di copie di DNA, ciascuna terminante con una diversa base (un diverso ddntp). Gruppo di frammenti 28 basi 27 basi 26 basi 25 basi 24 basi

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38 SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO METODO SANGER MODIFICATO

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41 Elettroferogramma

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43 DETERMINAZIONE DELLA QUALITA DI SEQUENZA

44 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer

45 NEWS:PYRISEQUENCING (PSQ) Direzione sintesi 5 3

46 PYRISEQUENCING (PSQ) Tecnica di recente sviluppo, basata sulla quantificazione luminometrica indiretta dei gruppi pirofosfato (PP) che vengono liberati dai nucleotidi incorporati durante la sintesi di un filamento di DNA complementare ad un templato stampo. VANTAGGI: Elevata accuratezza Altamente automatizzata 96 campioni processati in 20 minuti

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51 ANALISI DEI DATI Viene inserita la sequenza in una banca dati affidabile. Un software gestisce i dati, attraverso un confronto con sequenze di riferimento, e permette l identificazione della sequenza in esame

52 GENBANK Database EMBL, GenBank, Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms,www.ridom.de/mycobacteria/index. html

53 ANALISI POST-GENOMICHE Conoscere la sequenza genomica di un organismo non è che l inizio di una serie di esperimenti che potrebbero non essere stati concepiti in precedenza.

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