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1 Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, Roma Tel/fax: SEDE LEGALE: Via Helsinki 21, Roma Tel ; Fax orgabiohuman@fastwebnet.it CX26 DETECTION KIT Codice OBH-SC2-002 Instructions for use Store at -18 C to -25 C Package Insert, Revisione Reazioni 1

2 La Metodica Le mutazioni a carico del gene GJB2 rappresentano la principale causa delle sordità congenite non sindromiche a carattere recessivo. CX26 DETECTION KIT si basa su una metodica innovativa che permette di analizzare due mutazioni frequenti al locus GJB2, 35delG e la M34T, in tempi veloci (24-48h) e con costi contenuti rispetto all odierna analisi di sequenza. Il saggio consiste in una Multiplex PCR allele-specifica (SSP-PCR) tramite l utilizzo di un primer Forward (F) universale e due Reverse (R1 e Rtag) marcati e specifici per i 2 alleli della variante M34T. I primers Reverse sono stati marcati utilizzando il fluorocromo 6-FAM per l allele T ed il fluorocromo NED per l allele variante C. Il primer Rtag, che differisce dal primer R1 solo per la base C all estremità 3, è stato disegnato legando alla sua specifica sequenza, una coda nucleotidica al fine di aumentare le dimensioni dell amplicone ed evitare problemi di sovrapposizione del segnale La presenza della delezione (35delG) verrà rilevata mediante la quantificazione della dimensione dell amplicone che conterrà, se mutato, una base in meno rispetto al genotipo selvatico. In particolare, un campione eterozigote sarà caratterizzato da un elettroferogramma contenente due picchi di fluorescenza (6-FAM) che differiranno a livello dimensionale, per una sola base. Il genotipo relativo alla M34T è invece identificato dalla fluorescenza sequenza-specifica emessa dai primer R1 e Rtag. La presenza dell allele C sarà rilevata come un picco di fluorescenza NED, la presenza dell allele T non determinerà nessun picco di fluorescenza NED. Materiale all interno di ogni kit Il kit da 50 determinazioni è costituito da: N 4 vials contenenti 130 µl 1x Master Mix N 1 vial contenente 35U Hot Rescue Plus DNA Polymerase N 1 vial contenente 15 µl l Ladder Matariale necessario supplementare Kit di estrazione di DNA umano (es. QiAmp DNA mini kit Qiagen, H 2 0 sterile, Microcentrifuga da banco ( g. p. m.), Vortex, Micropipette 0.2/2-1/10 a volume variabile, Puntali con filtro DNAsi-free, Provette o piastre di reazione, Termociclatore, Sequenziatore con polimero POP7. Avvertenze e precauzioni Tutti i materiali biologici impiegati per l estrazione del DNA, per es. sangue o tessuto umano, devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici Si raccomanda l utilizzo di un DNA non degradato, con rapporto 260/280 maggiore o uguale a 1,8, e concentrato non meno di 4 ng/ l. Conservazione e stabilità Il kit è fornito senza ghiaccio secco, e va conservato a -20, tranne il Ladder che va conservato a 4. La 1x Master Mix va conservata a -20 ed al buio per via dei fluorofori presenti all interno dei primers. La data di scadenza è indicata sulla scatola. Prima dell utilizzo, scongelare la 1x Master Mix ed i controlli positivi. Evitare troppi cicli di congelamento e scongelamento attraverso l utilizzo di aliquote. Strumentazioni e polimeri da utilizzare Il kit è validato su ABI 3130 ed ABI Il polimero POP7 permette una corretta separazione elettroforetica sia nella fluorescenza NED che FAM. Pertanto, discrimina correttamente le mutazioni 35delG ed M34T e la loro fase, sia con ABI 3130 che con ABI Il polimero POP4 su ABI 3130 mostra una corretta separazione elettroforetica nella fluorescenza FAM, ma mostra una variabilità nell efficienza di separazione della fluorescenza NED. Pertanto, è possibile identificare correttamente la variante 35delG. Per la variante M34T è possibile verificare solo la sua presenza, ma no è possibile stabilire se è in eterozigosi od omozigosi, e la sua fase con la variante 35delG. L utilizzo del kit con altre strumentazioni ed altri polimeri deve essere accuratamente validato dal laboratorio che esegue il test. 2

3 Il Procedimento Preparare la miscela di reazione La miscela di reazione per ogni campione da tipizzare consiste di: Volume per 1 reazione (µl) 1X Master Mix 8 µl Hot Rescue Plus DNA Polymerase 0,14 µl DNA da testare (4-10 ng) +H 2 0 1,86 µl Per preparare la miscela di reazione, lavorare possibilmente al riparo dalla luce. Assicurarsi di aver scongelato correttamente tutti i reagenti, vortexare e spinanre prima dell uso. La quantità di DNA da utilizzare può variare tra 4 e 10 ng. Il volume finale di DNA+ H 2 0 deve essere di 1,86 µl. Se si utilizza ad esempio un DNA concentrato 10 ng/ µl, utilizzare 1 µl di DNA ed aggiungere 0,86 µl di H 2 0. Stabilire il numero di campioni da analizzare. Preparare in tubi da 0.2 il DNA, fino ad una concentrazione di 4-10 ng ed un volume di 1,86 µl. Preparare in eppendorf da 1.5ml la mix per il numero di campioni da analizzare, moltiplicando i volumi indicati in tabella 1. Aliquotare il contenuto della eppendorf nei tubi da 0.2 contenenti il DNA (8,14 µl di mix in ogni tubo da 0.2). Impostare il termociclatore (ciclo di PCR) Inserire la reazione di PCR in un termociclatore, utilizzando i seguenti parametri Step di PCR Temperatura Tempo Cicli Denaturazione iniziale min 1x Denaturazione sec Annealing sec 30x Extension sec Extension finale min 1x Settare i parametri per la corsa elettroforetica Il Run Method ABI 3130: FragmentAnalysis 36_POP7. In tabella sono riportati tutti i parametri di corsa. Il Run Method ABI 3500: FragmentAnalysis 50_POP7. In tabella sono riportati tutti i parametri di corsa. Nome Valori ABI 3130 Valori ABI 3500 Range Oven_Temparature DegC Poly_Fill_Vol steps Current_Stability µamps PreRun_Voltage kvoltsl Pre_Run_Time sec Injection_Voltage kvolts Injection_Time sec Voltage_Number_Of_Steps nk Voltage_Step_Interval sec Data_Delay_Time sec Run_Voltage kvolts Run_Time sec 3

4 Eseguire la corsa elettroforetica Per analizzare i singoli amplificati in elettroforesi capillare è necessario essere muniti di: Gene-Scan-500 Rox TM size standard (marcatore molecolare interno) e di Hi-Di Formammide e piastra compatibile con il sequenziatore a disposizione. 1. Allestire una mix costituita da 0,8µl di Gene-Scan-500 Rox TM size standard (o 500 Liz TM ) e 16µl Hi-Di Formammide (volumi che si riferiscono al singolo campione). La quantità di amplificato da caricare in piastra può variare fra 1 µl e 0.6 µl. E importante che in piastra sia caricato prima il campione e poi 16,8 µl di mix. Per il marcatore di corsa interno 500 Rox la matrice di corsa compatibile è la Multi-Capillary DS-30 (Dye set D) Matrix Standard Kit ( 6 FAM, HEX, NED, ROX Dye). Per il marcatore 500 Liz la matrice compatibile è la Multi-Capillary DS-33 (Dye set G5). 2. Eseguire la corsa utilizzando il Ladder fornito con il kit. Il Ladder produce una fluorescenza in FAM corrispondente a 2 picchi, ed una fluorescenza in NED corrispondente a 2 picchi. Caricare 1 µl di Ladder per eseguire la corsa elettroforetica. Il profilo del Ladder viene di seguito mostrato. Interpretare i risultati e determinare il genotipo L interpretazione dei risultati avviene tramite la comparazione dei tracciati elettroforetici del campione analizzato, con il tracciato elettroforetico del Ladder fornito dal kit. Utilizzando la Figura 1, è possibile determinare il profilo elettroforetico in FAM (sinistra) ed in NED (destra) del campione da genotipizzare. Per determinare il genotipo, collocare i profili elettroforetici FAM e NED ottenuti in Figura 1 all interno della Tabella 1. La tabella 1 mostra tutti i genotipi possibili, che, anche se mai riportati in letteratura, possono essere rilevati utilizzando CX26 detection kit. I genotipi identificati sperimentalmente, sono quelli mostrati all interno delle caselle gialle. Nelle caselle bianche sono mostrati i genotipi non osservati sperimentalmente. La presenza della variante M34T è rilevata da un picco di fluorescenza NED di intensità sovrapponibile (in termini di RFU) al segnale rilevato dalla fluorescenza FAM. Eccessivi sbilanciamenti di fluorescenza FAM/NED (esempio: se segnale NED è inferiore al 30% del segnale in FAM) possono derivare dalla presenza di aspecifici di PCR (vedi Troubleshooting, punto 4). 4

5 Troubleshooting Se CX 26 DETECTION KIT sembra non funzionare correttamente in laboratorio, cercate di seguire i consigli ed i suggerimenti nelle tabelle sottostanti. Se il DNA sembra non amplificarsi correttamente, il processo di risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla la PCR e/o sulle condizioni elettroforetiche. 1. Assenza di picchi di fluorescenza in elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA insufficiente o degradato Estrarre nuovamente il campione P C R Errato protocollo di PCR; Errato programma del Ricontrollare il protocollo suggerito, seguendo passo per passo la termociclatore metodica. Eventualmente ripetere il test 2. Picchi di fluorescenza troppo deboli D N A Possibile causa - DNA di scarsa qualità - Presenza di inibitori di PC - Scarsa quantità di templato di DNA Azione suggerita Ricontrollare la metodica di preparazione del campione delle soluzioni, e della loro conservazione Preparare nuovamente il DNA utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Estrarre nuovamente il campione P C R Protocollo di PCR non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test 3. Picchi di fluorescenza troppo intensi durante l elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire il DNA ed effettuare l amplificazione P C R Utilizzato un programma non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Eccessiva quantità di PCR caricata sul sequenziatore Diluire la PCR ed effettuare nuovamente la corsa elettroforetica 4. Sbilanciamento di intensità di fluorescenza dei picchi rilevati e/o presenza di segnali aspecifici al di fuori del limite di linearità dello strumento Possibile causa Azione suggerita D N A Quantità di DNA al di fuori del range consigliato Ripetere la PCR con quantità adeguate Utilizzare un controllo positivo di PCR Referenze [1] The genetics of deafness. Walter E. Nance. Ment Retard Dev Disabil Res Rev : , [2] Molecular genetics of hearing impairment due to mutations in gap junction genes encoding beta connexins. Hum Mutat Sep;16(3): , [3] Pathogenetic role of the deafness-related M34T mutation of Cx26. Hum Mol Genet Sep 1;15(17):

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8 CX26 DETECTION KIT Fabbricante Bios International Innovative Healthcare Division Viale Pinturicchio, Roma Tel Fax biosinternational.eu biosinternational.eu 8