Fisiologia dell emostasi

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1 1 STRATEGIE DIAGNOSTICHE PER L EMOFILIA A DEL CANE Marco Caldin DVM, PhD, ECVCP Diplomate 2 Fisiologia dell emostasi 1

2 3 Fisiologia dell emostasi 4 Attivazione emostatica 2

3 5 Emostasi primaria 6 Emostasi secondaria 3

4 7 Vie dell emostasi 8 Strategie diagnostiche Scelta del campione da analizzare Scelta del test (fenotipico vs genotipico) Interpretazione dei risultati 4

5 9 Scelta del campione Sangue intero 10 Scelta del campione Plasma EDTA 5

6 11 12 Scelta del campione Plasma citratato 3.8% 6

7 13 Scelta del campione Plasma citratato 3.2% 14 Scelta del campione Stabilità delle proteine coagulative Invio del campione coagulativo 7

8 15 16 Scelta del campione Sangue intero Plasma EDTA Plasma citratato 3.8% Plasma citratato 3.2% refrigerato 8

9 17 Scelta del test Test fenotipici Test genotipici 18 Test fenotipici aptt Fattore VIII 9

10 19 aptt Tempo di tromboplastina parziale attivata 20 Fattore VIII 10

11 21 Test genici Sequenziamento Biologia molecolare (PCR) 22 Ricerca clinica (Laboratorio San Marco) Ricerca clinica: individuare le basi molecolari dell emofilia A nel Pastore belga 3 soggetti (Pastore belga con emofilia A) 10 soggetti (Pastore belga con test coagulativi normali) Sequenziamento diretto per l intero gene codificante il Fattore VIII 11

12 23 Sequenziamento Amplificazione dei 26 esoni codifican2 il fa4ore VIII della coagulazione Mediante PCR è stato amplificato circa 13.0 kb del gene del famore VIII, che comprende l intera porzione codificante della sequenza del gene. Sono state condome 32 reazioni di PCR usando un set di 64 primers, disegna- mediante sotware Primer3, per l amplificazione delle 26 regioni codifican- il famore VIII della coagulazione. Sequenziamento Il DNA amplificato è stato purificato e somoposto a sequenziamento diremo mediante lo strumento ABI PRISM 3100 Gene-c Analyzer sequencer. TuMe le mutazioni nucleo-diche sono state confermate con la ripe-zione delle PCR e del sequenziamento. 24 Risultati Mediante sequenziamento diremo è stato possibile rilevare una mutazione pun-forme, a carico dell esone 15, con sos-tuzione di C al posto di T, in omozigosi. Tale mutazione non è stata riscontrata nei 10 sogge\ sani. 12

13 25 Obiettivi futuri: PCR Alles-mento di un saggio in PCR real- -me mediante un disegno di sonde taqman, con l u-lizzo del SW Primer Express. Rilevare la mutazione a carico dell esone 15 con tempi e cos- contenu-. 26 Interpretazione dei risultati Test fenotipici Test genotipici 13

14 27 Test fenotipici (aptt) Considerare che molte patologie sono in grado di alterare tale test: Insufficienza epatica, cattivo assorbimento intestinale, coagulazione intravascolare disseminata (DIC) 28 Test fenotipici (Fattore VIII) Considerare che alcune patologie possono determinare riduzione del fattore VIII (DIC) aptt PT Fibrinogeno FDPs DD Antitrombina 14

15 29 Test genotipici: (PCR per mutazione fattore VIII) Facili da interpretare purchè le basi molecolari della emofilia (razza specifiche) siano molto chiare 30 Corretto inquadramento clinico Razza Età Segni clinici Test ematici/urinari generali Test coagulativi specifici Test genetici 15

16 31 Considerazione finale Una diagnosi è costituita da un insieme di informazioni cliniche sequenziali al pari di una casa costituita da un insieme ordinato di mattoni. Ma come un mucchio di mattoni non costituisce una casa, un insieme di dati di laboratorio non costituiscono una diagnosi clinica 32 Ringraziamenti Al dr. Michele Trotta e dr.ssa Martina Micetto Servizio di Biologia Molecolare del Laboratorio Veterinario San Marco, Padova 16