PRODA Istituto di Diagnostica Clinica

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1 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica Molecolare Responsabile Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Informazioni sull analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi prenatale (36 mutazioni + 21 mutazioni regionali italiane) Che cos e la fibrosi cistica La fibrosi cistica è una malattia ereditaria, cronica, evolutiva, caratterizzata dalla produzione di muco particolarmente denso, viscoso, che tende ad ostruire i bronchi ed i dotti del pancreas. Un bambino ogni circa nasce con questa malattia. La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, danneggiando l apparato respiratorio (con presenza di tosse persistente, bronchiti ricorrenti, sinusite, poliposi nasale) e disturbando la digestione (con difficoltà nella crescita). Inoltre, negli uomini si manifesta sterilità di tipo ostruttivo e nelle donne una riduzione della fertilità. A volte possono essere presenti anche ostruzione intestinale alla nascita, diabete ed alterazioni del fegato. La fibrosi cistica può esprimersi con maggiore o minore gravità in individui diversi e viene pertanto trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, costituite per lo più da fisioterapia, antibiotici, aerosol-terapia, estratti pancreatici e vitamine. Il decorso e la prognosi della fibrosi cistica sono notevolmente migliorati negli ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Nonostante ciò, allo stato attuale la guarigione non è possibile e la durata media della vita è comunque ridotta rispetto a quella della popolazione generale. Come si trasmette la malattia La fibrosi cistica è determinata da alterazioni, chiamate mutazioni, a livello di una specifica coppia di geni, definiti CFTR. I geni sono sequenze di una sostanza chimica complessa, chiamata DNA, e vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Ogni persona eredita complessivamente oltre coppie di geni dai suoi genitori. In un malato di fibrosi cistica entrambi i geni CFTR sono difettosi. Viceversa, un portatore di fibrosi cistica è un individuo sano che possiede un gene difettoso ed un gene normale. I portatori di fibrosi cistica sono circa il 4% della popolazione, cioè una persona ogni 25 circa è portatrice. Una coppia costituita da due portatori ha ad ogni gravidanza un rischio del 25% di generare un figlio malato (se vengono trasmessi entrambi i geni alterati), ed una probabilità del 75% di generare un figlio sano, che può essere portatore o non portatore. Come si esegue l analisi genetica Per eseguire l analisi genetica è necessario il prelievo di un campione di sangue. Dalle cellule del sangue viene estratto il DNA. Sul DNA si esegue l analisi della coppia di geni della fibrosi cistica per la ricerca di una eventuale mutazione. L analisi fornisce informazioni solo riguardo alla fibrosi cistica. Le mutazioni possibili sono numerosissime (circa 1200), molte di esse sono rare, molte altre ancora sconosciute: abitualmente l analisi genetica ricerca le più frequenti; non è in grado di identificarle tutte. 1

2 Materiali e metodi utilizzati La tecnica adottata per l analisi di 57 tra le più frequenti mutazioni del gene CFTR nella popolazione italiana (36 mutazioni più frequenti + 21 mutazioni regionali italiane) utilizza 33 coppie di primers che amplificano tratti di DNA ove sono localizzate le mutazioni stesse, combinate in 3 multiplex PCR. La presenza o l assenza delle mutazioni viene valutata mediante ibridazione inversa non radioattiva (LiPA - Line Probe Assay) su striscia. Di seguito è riportato l elenco delle 36 mutazioni più frequenti + 21 mutazioni regionali italiane per le quali si effettua la ricerca: G85E E60X 394delTT 621+1G>T R117H 711+5G>A R347P R334W A455E ΔF508 ΔI507 G542X G>A G551D R553X R560T Q552X 2183AA>G 2184delA 2143delT G>A R1162X 3659delC KbC>T W1282X S1251N N1303K CFTRdele2,3(21Kb) 711+1G>T 1078delT 3905insT A>G G>A I148T G>A 3199del Mutazioni regionali Italiane 1259insA 4016insT 4382delA D579G 4016insT 852del22 R347H E217G G1244E G1349D L1065P R334Q T338I 991del A>G I1502 S549R(A>C) D1152H D1152H R1066H 621+3A>G Le mutazioni su indicate costituiscono circa il 75% delle mutazioni presenti nella popolazione italiana (sensibilità). La capacità di rilevazione di mutazioni del gene CFTR da parte del test, comparata con la percentuale di rilevazione considerando tutte le mutazioni del gene CFTR fino ad oggi evidenziate nella popolazione italiana, è superiore al 97% (Rendine et al, 1997; Bombieri e Pignatti, 2001). Il test è altamente specifico: non sono state evidenziate cross-reazioni con mutazioni rare o polimorfismi in prossimità delle posizioni delle sonde utilizzate nel kit. Che risultati puo dare l analisi genetica per fibrosi cistica e che implicazioni comporta per la gravidanza Nel caso di richiesta di analisi molecolare per Fibrosi Cistica in gravidanza il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate, viene valutata la diagnosi prenatale molecolare (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto;vedi oltre). Con l attuale analisi si possono avere due tipi di risultati: - l analisi individua nel DNA la presenza di una mutazione del gene CFTR (si dice che il soggetto risulta positivo al test). Questo risultato significa che il soggetto è un portatore. - l analisi non individua la presenza di mutazioni del gene della fibrosi cistica (si dice che il soggetto risulta negativo al test). Questo risultato significa che il soggetto ha una probabilità diminuita, rispetto a prima dell analisi, di essere un portatore ( 1%). Non è possibile che l analisi escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perché non è possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica; 2

3 Ciò implica che: - se entrambi i membri di una coppia sono negativi al test, la probabilità di avere un figlio affetto è inferiore a quello della popolazione generale (1 probabilità su ); - se entrambi risultano positivi al test (entrambi portatori), il rischio di avere un figlio affetto è pari al 25% (cioè ad 1 probabilità su 4) ad ogni gravidanza. In questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto; - se, infine, un genitore è positivo al test (portatore) e l altro è negativo, il rischio di avere un figlio affetto è superiore a quello della popolazione generale (cioè 1 su 400). In questa circostanza la diagnosi prenatale molecolare (test di esclusione fetale) permette di escludere la malattia nel feto solo nel 50% dei casi; mentre negli altri casi, la mancata esclusione raddoppia il rischio di malattia nel feto (1 su 200). In tali circostanze è comunque possibile fare ricorso anche ad indagini prenatali di altra natura per ottenere una migliore definizione del rischio, mentre tecniche più complesse di analisi molecolare per la ricerca di mutazioni fibrosi cistica (eseguibili preferibilmente in fase preconcezionale come analisi di II livello- DDGE, DHPLC, sequenziamento- e valutate comunque in un colloquio specialistico di consulenza genetica), richiedono tempi lunghi di esecuzione e costi elevati e, comunque, non arrivano mai ad escludere la presenza di mutazioni (sensibilità non assoluta, difficoltà nell interpretare varianti di sequenza dalle incerte conseguenze cliniche). Problematiche e limiti dell analisi genetica molecolare In generale le analisi genetiche sono indagini di sviluppo recente, continuamente sottoposte a revisione e perfezionamento. E possibile che per problemi tecnici,in una percentuale molto bassa di casi (inferiore all 1%) il test genetico per fibrosi cistica vada ripetuto o fornisca un risultato sbagliato. E importante ricordare che: La probabilità di trovare una mutazione (e quindi di ricevere la diagnosi di portatore di fibrosi cistica) è maggiore per un soggetto che sia parente di un malato o di un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la mutazione del malato o del portatore presente in famiglia (mutazione familiare ) e poi ricercarla nel parente; Se un individuo imparentato con un malato chiede l analisi genetica e non è stato possibile identificare la mutazione familiare nel soggetto malato, o nel caso di diagnosi prenatale uno dei due genitori è portatore di una mutazione non identificabile, è necessario ricorrere ad indagini più complesse che coinvolgono oltre al malato altri familiari (analisi indiretta mediante siti polimorfici, ovvero sequenze diverse, ma normali, di DNA ereditabili in associazione al gene CFTR) che comportano un moderato aumento di rischio di errore e che non sempre possono fornire un risultato. Quando siano coinvolti più familiari, se i legami di parentela di coloro che si sottopongono al test sono diversi da quanto dichiarato, il test può rivelare tale situazione (ad esempio quando il padre anagrafico non sia quello biologico), oppure può fornire un risultato sbagliato. Una diagnosi sbagliata in un membro di una famiglia può portare ad altri errori diagnostici per altri soggetti di quella famiglia. Il risultato dell analisi genetica può condurre a fare diagnosi non solo di portatore, ma anche di malato di fibrosi cistica, qualora nel soggetto analizzato vengano individuate non una, ma due mutazioni del gene della fibrosi cistica. Il risultato dell analisi genetica può condurre a considerare l eventualità di una diagnosi prenatale. E importante ricordare che casi eccezionali di fibrosi cistica potrebbero essere dovuti a mutazioni de novo, alleli complessi (combinazioni di più polimorfismi diversi in grado di influenzare la funzionalità del gene), disomia uniparentale. Nell 1% dei pazienti con fibrosi cistica tipica eterogeneità genetica (coinvolgimento di geni diversi dal CFTR) non può essere esclusa. 3

4 E importante sottolineare che: in rari casi un risultato non interpretabile può evidenziarsi a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3 dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari. E possibile che siano presenti altre mutazioni ma, che non essendo incluse nel kit, non siano rilevabili Il test LiPA non è in grado di rilevare se le 2 mutazioni di un paziente eterozigote composto siano presenti su uno o 2 cromosomi (in cis o in trans). Solo lo studio del DNA parentale potrà dare indicazioni sulla fase cromosomica. In considerazione delle problematiche sopra esposte, in concomitanza del test genetico viene sempre offerta una consulenza genetica. I risultati ottenuti con l analisi del DNA sono strettamente confidenziali; potranno essere comunicati ad altre persone solo dopo autorizzazione dell interessato. Referenti per l analisi genetica per fibrosi cistica Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l analisi molecolare sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l eventuale test molecolare di FC sul feto, sono precedute da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica medica, che ha la finalità di trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a comprenderne il significato e le implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso informato degli interessati. Il prelievo di sangue e l analisi molecolare sono effettuati presso i laboratori dell Istituto di Diagnostica Clinica PRODA nella sede di via Russolillo. 4

5 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica Molecolare Responsabile Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Consenso informato all indagine genetica per fibrosi cistica (36 mutazioni + 21 mutazioni regionali italiane) Ho preso visione delle informazioni allegate, che ho integrato con ulteriori precisazioni fornite dal Dottor... Avendo compreso il significato e le implicazioni di questa procedura, chiedo di sottopormi all indagine genetica per la ricerca delle più frequenti mutazioni associate alla fibrosi cistica (36 mutazioni + 21 mutazioni regionali italiane). La mia richiesta di sottopormi al test è completamente volontaria. Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al Laboratorio. Sono consapevole che raramente l analisi può fornire un risultato errato ma che, comunque, la probabilità di un errore diagnostico è inferiore all 1%. In rarissimi casi può evidenziarsi un risultato non interpretabile a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3 dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari. Sono consapevole che nel caso di richiesta di analisi molecolare per FC in gravidanza il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate, viene veffettuata la diagnosi prenatale molecolare per FC (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto). Sono, inoltre, consapevole che, per una corretta e completa interpretazione conclusiva, sarà opportuno esibire al Medico che ha prescritto l esame, il risultato del test consegnatomi dal Laboratorio. Dati anagrafici del paziente Cognome: Nome: Data e luogo di nascita: Indirizzo: Recapito telefonico: Roma, Firma del paziente Firma del Medico che ha raccolto il consenso 5