Stato mutazionale del gene K-RAS: K comparazione di metodi di analisi

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1 IV Congresso Regionale I Congresso del Middle Management di Area Tecnica Federazione Italiana Tecnici di Laboratorio Biomedico Stato mutazionale del gene K-RAS: K comparazione di metodi di analisi Dott.ssa Vecchio Liliana Caterina U.O. Anatomia Patologica Osp. Castelfranco Veneto, Treviso Maniago 11 Maggio 2013

2 Dipartimento di medicina di laboratorio e istologia e anatomia patologica Tre unità operative dirette da tre figure apicali. Operanti in due presidi ospedalieri (Castelfranco e Montebelluna). 25 dirigenti + 1 borsista 57 TSLB

3 Passato Tutte le unità operative eseguivano test di biologia molecolare in modo indipendente PCR southern-blot per HBV (1987) Riarrangiamento genico dei linfomi T e B (1987) Costituenti virali di HCV (1993) Genotipo HCV (1993) HPV, Apo-E (1995) SMA (1997) Micobatterio, Emocromatosi (1998) Celiachia (2002), resistenza alla Lamivudina ecc.

4 Passato Studio dell emofilia emofilia (1995) Variante II protrombina Mutazione V Leiden Jack2 Cromosoma Philadelfia HLA Dal 2007 Chlamydia Trachomatis,, Batteri tubercolari (casi selezionati).

5 Stato dell arte Nell anno 2009 costituzione del gruppo dipartimentale di biologia molecolare. 3 Dirigenti biologi strutturati 1 biologo borsista 7 tecnici dedicati

6 Stato dell arte Scopo principale l ottimizzazione l delle risorse umane e la riduzione dei costi di gestione Strumentazione condivisa (estrattore automatico, lightcycler, pyrosequencing). Ottimizzazione degli spazi

7 Stato dell arte Introduzione di nuovi esami Fibrosi cistica, per ridurre fuga verso l esterno K-RAS, EGFR, B-RAF, B chlamydia pneumoniae,, per rispondere a nuove esigenze cliniche (in allestimento).

8 Stato dell arte Nuova modalità operativa Esami condivisi Questo ci ha portato ad un nuovo modo di operare e come vedremo in seguito ad esempio la valutazione della nuova strumentazione da acquisire.

9 Importanza di K-RASK La Ricerca dello stato wilde-type o mutazionale, fornisce all oncologo l informazione sul target terapeutico adeguato al trattamento del carcinoma del colon-retto.

10 Le proteine RAS Le proteine RAS appartengono alla superfamiglia delle GTPAsi Attivazione attraverso recettore EGFR Sono proto-oncogeni oncogeni

11 Le proteine RAS Partecipano alla trasduzione del segnale cellulare indotto dall' EGFR ai target intracellulari attraverso una serie di reazioni a cascata, che regolano lo sviluppo e le funzioni cellulari. Normalmente oscillano tra una conformazione attiva ed una inattiva, i cui livelli in condizioni fisiologiche sono strettamente controllati.

12 Le mutazioni del gene RAS Mutazioni del gene KRAS determinano la sintesi di proteine aberranti costitutivamente nella forma attiva, che sono in grado di perpetuare la trasduzione del segnale anche in assenza di qualsiasi stimolazione a monte dei recettori EGFR/HER. L' attivazione oncogenica dei meccanismi di trasduzione del segnale RAS è implicata in molti aspetti del processo neoplastico, tra cui crescita cellulare e proliferazione incontrollata e differenziazione anomala della cellula.

13 Progetto K-RASK Comparazione di metodi di analisi: Sequenziamento diretto Reverse Dot-Blot Blot, Valutazione dei risultati analitici dei tre metodi Valutazione dei costi di gestione Pyrosequencing

14 Progetto K-RASK 42 soggetti di età media di 66,8 anni (range 36-81) 29 di sesso maschile e 13 di sesso femminile 44 campioni istologici di cui: 36 da resezione segmentaria del grosso intestino, 1 da frustolo epatico, 2 da porzione di parenchima epatico, 1 da biopsia endoscopica polipoide del colon (screening), 1 da biopsia endoscopica del retto e 2 da resezione polmonare

15 Progetto K-RASK Sede del prelievo Resezione segmentaria del grosso intestino Agobiopsia di frustolo epatico Porzione di parenchima epatico Biopsia endoscopica polipoide (screening) Adenocarcinoma infiltrante Frustolo epatico focolaio di adenocarcinoma intestinale matastatico Metastasi epatica Diagnosi istologica Adenoma tubulo-villoso con displasia epiteliale di alto grado e area di adenocarcinoma infiltrante Numero di campioni Biopsia endoscopica del retto Resezione polmonare Adenocarcinoma infiltrante tipo enterico Neoplasia primitiva del polmone, adenocarcinoma acinare multifocale infiltrante 1 2

16 Progetto K-RASK Confronto tra sequenziamento diretto e reverse dot-blot (19 prelievi di 17 pazienti) Ulteriori 25 campioni analizzati con la tecnica reverse dot-blot 14 casi selezionati sono sottoposti a pyrosequencing

17 Risultati Mutazione K-RAS K codone Tipo di mutazione G12D G13D G12C G12A G12S G12V Frequenza % % % 4.55 % 4.55 % 2.27 % 2.27 %

18 Risultati Sei mutazioni riscontrate (codone posizione 2) 50% dei campioni WT e 50% mutati Concordanza del 100% tra i metodi confrontati Analisi dei codoni 61 posizione 3 e 146 posizione 1, possibile solo con il pyrosequencing

19 Risultati Con Reverse dot-blot presenza di bande aspecifiche che hanno indotto la ripetizione

20 Risultati

21 Valutazione dei costi Tabella dei costi Grezzi Sequenziamento diretto Reverse dot-blot Pyrosequencing Reagenti Non disponibile in base alla numerosità 100 in base al nostro service Strumentazione Non disponibile Non necessaria strumentazione dedicata (costata circa ) acquisto canone noleggio annuo compresa manutenzione (nostro service) Manutenzione Non disponibile / / Personale Non disponibile 23,27 23,27 Ore dedicate Non disponibile 4,25 3,5

22 Valutazione dei costi Tabella dei costi per campione (previsioni 2012) Sequenziamento diretto Reverse dot-blot Pyrosequencing Dati ULSS 9 Dati ULSS 8 Dati ULSS 8 Estrazione / / / Reagenti Non disponibile Canone noleggio e manutenzione Non disponibile 0 18 Costi ammortamento Non disponibile 1 6,75 Manutenzione Non disponibile 0,25 0 Personale Non disponibile 98,9 81,45 Totale Non disponibile 220,15 206,2

23 Reverse dot-blot vs Pyrosequencing Il metodo Reverse dot-blot ha dimostrato una totale concordanza con il metodo di riferimento (sequenziamento diretto) mostrando: una sensibilità pari all 1% di sequenze mutate. una specificità quasi pari a quella del sequenziamento, con un accuratezza diagnostica superiore al 98%

24 Pyrosequencing vs Reverse dot-blot Pyrosequencing ha dimostrato una totale concordanza con il metodo di riferimento (sequenziamento diretto) mostrando: Sensibilità del 5% possibilità di sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando eventuali problematiche legate alla sua frammentazione dovuti alle procedure di fissazione e inclusione

25 Considerazioni finali Questo lavoro ha evidenziato come i tre metodi siano sostanzialmente comparabili fornendo risultati con una concordanza pari al 100% Possiamo affermare come Reverse dot-blot a fronte di una elevata sensibilità abbia costi di gestione sostanzialmente superiori al Pyrosequencing nell ordine del 6% circa. Inoltre secondo il nostro orientamento, Reverse dot-blot risulta essere un sistema poco flessibile rispetto al Pyrosequencing.

26 Ruolo del TSLB Collaborare in maniera incisiva nella scelta della strumentazione dobbiamo essere più partecipi nelle scelte strategiche. Dobbiamo acquisire capacità e competenze non solo per essere di riferimento ai colleghi più giovani ma anche per la gestione dei processi di cambiamento.

27 Prospettive future Le nostre conoscenze si sono ampliate notevolmente, ma non devono mai fermarsi (la scuola non finisce mai). La nostra competenza va fatta apprezzare a chi ci sta intorno (chiediamo di collaborare). Ciascuno di noi insieme agli altri può rendere la squadra più forte (vincente).

28 Conclusioni Non è il lavoro che fa i professionisti, ma sono i professionisti che costruiscono il lavoro.

29 Grazie per l attenzionel

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