CX26-CX30 DETECTION KIT

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1 IVD IVD Diagnostici in Vitro CX26-CX30 DETECTION KIT Kit Per l identificazione delle principali delezioni nei geni GJB2 (CX26) e GJB6 (CX30) Codice OBH-SC-003 Fabbricante: Orga Bio Human S.r.l. 50 Test Store at -18 C to -25 C Data sheet, Revisione 1.2 (01/08/2014) 1 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

2 Introduzione La sordità neurosensoriale è una grave forma di patologia multifattoriale che colpisce 1/1000 nati vivi nei paesi industrializzati. Ad oggi si stima che circa il 50-70% delle sordità è ad eziologia genetica con eredità mendeliana o mitocondriale. E stato riscontrato che in circa il 77-80% dei casi la trasmissione è autosomico-recessiva, nel restante 20% è autosomico-dominante e meno dell 1% sono i casi a trasmissione X-linked e mitocondriale. Le forme di ipoacusia sono distinte in: non sindromiche, caratterizzate esclusivamente da sordità ad insorgenza precoce (già alla nascita), e sindromiche, caratterizzate da un fenotipo complesso. La diagnosi di ipoacusia non sindromica viene condotta tramite lo screening diretto dei geni GJB2 e GJB6, che rispettivamente codificano per la connessina 26 e 30. Le connessine sono una particolare categoria di proteine implicate nella formazione di canali che permettono la comunicazione intercellulare. Nella popolazione caucasica la variante più frequente (2.23%), riscontrata in almeno 80% dei casi, è la delezione in posizione 35 di una singola guanina (35delG) che altera il normale quadro di lettura della sequenza genica con conseguente arresto nella sintesi della connessina 26. Inoltre è stato stimato che la frequenza dei portatori sani nel bacino del Mediterraneo oscilla tra 1/25 e 1/45. Fra le oltre 90 mutazioni a carico del gene GJB2 ed esclusa la 35delG, un altra delezione di particolare interesse è le 167delT, con frequenza pari a 3-4% negli ebrei Ashkenazi. Un altra mutazione, coinvolta nell eziologia dell ipoacusia non sindromica frequente nelle popolazioni del bacino Mediterraneo, è la del Delezione D13S1830 nel gene GJB6 (13q12.11). Questa delezione di 342 Kb ha una frequenza inferiore ad 1 su 100, ma è importante in quanto è la seconda mutazione in circa il 50% degli eterozigoti Cx26 affetti da sordità. L analisi mutazionale dei loci coinvolti in queste forme di sordità, ad oggi viene effettuata tramite sequenziamento diretto (come da linee guida per l inquadramento diagnostico delle ipoacusie genetiche, gruppo di lavoro SIGU) e successiva interpretazione degli elettroferogrammi. Questa metodica, efficace nel determinare con accuratezza eventuali alterazioni di sequenza, richiede un laborioso processamento manuale del campione con sensibile incremento dei costi e del tempo di risposta. Cx26-Cx30 Detection Kit permette di indagare tre delezioni a carico dei geni GJB2 e GJB6 attraverso una PCR multiplex per garantire una risposta rapida, economica e riproducibile. 2 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

3 La Metodica CX26-CX30 Detection kit è in grado di identificare le delezioni 35delG e 167delT in GJB2 (CX26), e la delezione D13S1830 in GJB6 (CX30) correlate con sordità neurosensoriale. Il saggio consiste in una PCR multiplex in cui vengono amplificati i tre loci genomici corrispondenti alle tre delezioni. La multiplex PCR viene separata in elettroforesi capillare per l interpretazione dei dati. La separazione elettroforetica delle PCR mostra dei picchi specifici per ogni allele: - Allele wild-type per 167delT= 125bp; allele mutato per 167delT=125 1 bp - Allele wild-type per la 35delG=195bp; allele mutato per 35delG=195 1 bp - Allele wild type per la D13S1830 = 335bp; allele mutato per la D13S1830 = 404bp In Figura 1 è mostrata una corsa elettroforetica di Cx26-Cx30 Detection kit. In particolare, è mostrato un soggetto eterozigote per la 167delT (presenza di un doppio picco elettroforetico), wild type per la 35delG (un solo picco elettroforetico), e wild type per la D13S1830. Per una corretta interpretazione della corsa elettroforetica ed in generale del corretto utilizzo del kit si raccomanda di consultare il paragrafo Interpretare i risultati e determinare il genotipo. Figura 1. Profilo elettroforetico di CX26-CX30 Detection kit. 3 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

4 Materiale all interno di ogni kit Il kit da 50 determinazioni è costituito da: N 4 vials contenenti 180 µl 1x Mix N 1 vial contenente 16 µl 5U/µl Hot Rescue Plus DNA Polymerase Matariale necessario ma non fornito Kit di estrazione di DNA umano (es. QiAmp DNA mini kit Qiagen); Microcentrifuga da banco ( g. p. m.); Termostato per le provette tipo eppendorf con range di temperatura da 25 a 100 c (solo per alcuni kit di estrazione); Cappa biologica; Puntali dotati di filtro (prevenzione aerosol); Micropipette da 0,5-10 μl; 5-50 μl; μl; μl; Guanti lattice, camice; Provette in polipropilene con tappo da 0,2 ml e da 1,5 ml o 2 ml; Portaprovette; Termociclatore; Sequenziatore, polimero, Formammide, size standard; H 2 0 sterile; Vortex; Avvertenze e precauzioni Tutti i materiali biologici impiegati per l estrazione del DNA devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici Si raccomanda l utilizzo di un DNA non degradato, con rapporto 260/280 maggiore o uguale a 1,8. Inoltre si raccomanda di: 1. Indossare guanti monouso durante l uso dei reagenti e dei campioni, lavarsi accuratamente le mani al termine della seduta lavorativa. 2. Non pipettare con la bocca. 3. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici e non maneggiare lenti a contatto nelle aree di lavoro del laboratorio. 4. Non usare il kit dopo la data di scadenza. 5. Eliminare tutti i campioni ed i materiali utilizzati per il test come se potenzialmente in grado di trasmettere infezioni. La loro eliminazione deve avvenire seguendo le normative di legge vigenti. 6. Manipolare all interno di una cappa biologica (in accordo con quanto descritto nella pubblicazione Biosafety Level 2, o linee guida equivalenti) tutti i materiali contenenti o sospettati contenere agenti infettivi. 7. Pulire e disinfettare tutte le superfici di lavoro utilizzando un disinfettante come ad es. l ipoclorito di sodio allo 0,5%, o un altro disinfettante idoneo. 8. Evitare ogni contatto della pelle e delle mucose con i campioni e reagenti del kit. In caso di contatto, lavare abbondantemente con acqua le parti esposte e consultare un medico. 4 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

5 9. Organizzare in modo unidirezionale le fasi operative per l allestimento della reazione e l utilizzo del kit, al fine di prevenire l eventuale contaminazione dei reagenti con prodotti amplificati. È buona norma mantenere separate le aree e le dotazioni dedicate, rispettivamente, alla fase di estrazione dei campioni e di allestimento ed esecuzione delle procedure di amplificazione. 10. Utilizzare puntali con filtro e guanti sterili DNA free. 11. Conservare i campioni da analizzare separatamente da tutti gli altri reagenti e, se possibile, aggiungerli nelle Mix per la reazione in aree separate. 12 Scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente prima di iniziare un saggio, mixare i componenti e centrifugare brevemente. Conservazione e stabilità Il kit va conservato a -20. La data di scadenza è indicata sulla scatola. Prima dell utilizzo, scongelare tutte le 1x Master Mix. Evitare troppi cicli di congelamento e scongelamento attraverso l utilizzo di aliquote. Ripetuti congelamenti e scongelamenti possono ridurre la sensibilità e devono essere evitati. E consigliato congelare le Mix in aliquote per eventuali usi intermittenti. Strumentazioni e polimeri da utilizzare CX26-CX30 Detection kit è stato testato utilizzando la seguente strumentazione: Termociclatori Verity Applied Biosystems 2720 Applied Biosystems Personal Biometra PeqSTAR Euroclone Sequenziatori e relativi polimeri: Applied Biosystems ABI 3130 POP7 Applied Biosystems ABI 3500 POP7 L utilizzo del kit con altre strumentazioni ed altri polimeri deve essere accuratamente validato dal laboratorio che esegue il test. Materiale di partenza L utilizzo del kit è stato testato su DNA estratto da sangue periferico e liquido amniotico. Per ogni analisi, si raccomanda di utilizzare DNA con un rapporto 260 nm vs 280 nm compreso tra 1.8 e 2. 5 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

6 Il Procedimento Preparare le miscele di reazione Per eseguire l amplificazione, allestire una Mix di PCR come mostrato in Tabella 1. Volume per 1 reazione Mix 1X Master Mix µl 5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase 0,16 µl DNA da testare (2-5 ng) +H µl Volume Finale 15 µl Tabella 1. Protocollo per la preparazione della Mix di PCR Accorgimenti In ogni corsa è necessario includere un controllo negativo (acqua) per valutare eventuali contaminazioni. Si suggerisce inoltre di includere un campione con i genotipi noti per saggiare la corretta esecuzione del test ( valutazione del corretto genotipo delle tre delezioni) e per valutare e stimare l accuratezza diagnostica di laboratorio. Per preparare le miscele di reazione, lavorare possibilmente al riparo dalla luce. Assicurarsi di aver scongelato correttamente tutti i reagenti, vortexare e spinnane prima dell uso. Il volume finale di DNA+ H 2 0 deve essere di 2 µl. Se si utilizza ad esempio un DNA concentrato 10 ng/ µl, utilizzare 3 µl di DNA ed aggiungere 7 µl di H 2 0. Si raccomanda particolare attenzione nel manipolare volumi di reazione così piccoli. Si suggerisce inoltre di rieffettuare il dosaggio del DNA una volta effettuate la diluizione. Stabilire il numero di campioni da analizzare. Preparare in tubi da 0.2 µl il DNA, fino ad una concentrazione di 2-5 ng ed un volume di 2 µl. Preparare in eppendorf da 1.5ml la mix per il numero di campioni da analizzare, moltiplicando i volumi indicati in tabella 1. Aliquotare il contenuto della eppendorf nei tubi da 0.2µl contenenti il DNA (13 µl di mix in ogni tubo da 0.2). Impostare il termociclatore (ciclo di PCR) Caricare le reazioni di PCR nel termociclatore utilizzando i parametri riportati nella tabella 2. Step di PCR Temperatura Tempo Cicli Denaturazione iniziale min 1x Denaturazione sec Annealing sec 30x Extension 72 1 min 30 sec Extension finale min 1x Tabella 2. Condizione da utilizzare nel termocilcatore 6 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

7 Settare i parametri per la corsa elettroforetica A seconda del sequenziatore utilizzato e del relativo polimero, sono riportati in Tabella 3 i parametri raccomandati per eseguire le corse elettroforetiche. ABI 3130 Polimero POP7 Capillary length (Centimetri) 36 Oven_Temparature (Gradi) 60 Poly_Fill_Vol (STEP) 6500 Current_Stability (AMP) 50 PreRun_Voltage (KVolts) 15 Pre_Run_Time (Secondi) Injection_Voltage (KV) 1.02 Injection_Time (Secondi) 23 Voltage_Number_Of_Steps 20 Voltage_Step_Interval 15 Data_Delay_Time 60 Run_Voltage (KVolts) 15 Run_Time (Secondi) 1200 ABI 3500 Polimero POP7 Capillary length 50 Oven_Temparature (Gradi) 60 Run_Voltage (KVolts) 19,5 PreRun_Voltage (KVolts) 15 Injection Voltage (KVolts) 1,6 Run_Time (Secondi) 1330 PreRun_Time (Secondi) 180 Injection Time (Secondi) 8 Data Delay (Secondi) 1 Tabella 3. Parametri da utilizzare per la corsa elettroforetica con ABI 3130 ed ABI 3500 Settare i BINS Delezione Allele Paia di basi 167delT WT 122 Delezione T delT WT 195 Delezione G D13S1830 WT 335 Delezione 342 Kb CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

8 Tabella 4. Per ogni delezione indagata, sono mostrati i pesi molecolari dei relativi picchi elettroforetici attesi. Eseguire la corsa elettroforetica Per analizzare i singoli amplificati in elettroforesi capillare è necessario essere muniti di: Gene-Scan-500 Rox TM size standard e/o Gene-Scan-500 Liz TM (marcatore molecolare interno) e di Hi-Di Formammide e piastra compatibile con il sequenziatore a disposizione. Allestire una mix costituita da ABI 3130 Gene-Scan-500 RoxTM size standard (o 500 LizTM) 0,6µl Hi-Di Formammide 16µl Amplificato c 1µl Volume finale per singolo campione 17,6 µl ** N.B. Diluire ogni amplificato 1:10 ( es. 1µl di amplificato + 9µl H 2 O PCR grade. ABI 3500 Gene-Scan-500 RoxTM size standard (o 500 LizTM) 0,2µl Hi-Di Formammide 10µl Amplificato (diluito 1:10) 1µl Volume finale per singolo campione 11,2 µl Tabella 5. Mix da allestire per la corsa elettroforetica in ABI 3130 e 3500 Si raccomanda inoltre di: 1. Caricare in piastra prima il campione e poi la Mix. 2. Utilizzare la matrice di corsa compatibile. Per il marcatore di corsa interno 500 Rox la matrice di corsa compatibile è la Multi-Capillary DS-30 (Dye set D) Matrix Standard Kit ( 6 FAM, HEX, NED, ROX Dye). Per il marcatore 500 Liz la matrice compatibile è la Multi-Capillary DS-33 (Dye set G5) Matrix Standard Kit(6-FAM, VIC, NED, PET, and LIZ Dye). 3. Denaturare i campioni 2 minuti a Eseguire la corsa utilizzando sempre il DNA di un soggetto sano. Interpretare i risultati e determinare il genotipo L interpretazione dei risultati necessita la valutazione della presenza assenza dei picchi elettroforetici nella fluorescenza 6 FAM mostrato di seguito. 8 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

9 Delezione 167delT. L allele WT produce un picco elettroforetico di 125 bp. La delezione (167delT) in eterozigosi produce un doppio picco elettroforetico. WT Eterozigote 167delT Delezione 35delG. L allele WT produce un picco elettroforetico di 196 bp. La delezione (35delG) in eterozigosi produce un doppio picco elettroforetico. WT Eterozigote 35delG Delezione D13S1830. L allele WT produce un picco elettroforetico di 405 bp. La delezione (D13S1830) in eterozigosi produce due picchi elettroforetici di 405 e d 334 bp. WT Eterozigote D13S1830 Per interpretare correttamente i risultati: - Settare i Bin, come mostrato precedentemente - Confrontare la corsa elettroforetica con quella di un DNA di riferimento. Sono da considerare accettabili, e quindi interpretabili, le corse elettroforetiche in cui tutti i segnali di fluorescenza attesi presentino valori di RFU (Relative Fluorescence Unit) maggiori di Nel caso in cui i valori di RFU non rispettino i suddetti valori di riferimento, l esperimento deve essere considerato non valido e quindi ripetuto (vedi troubleshooting). 9 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

10 Troubleshooting Se Cx26-Cx30 DETECTION KIT sembra non funzionare correttamente in laboratorio, cercare di seguire i consigli ed i suggerimenti nelle tabelle sottostanti. Se il DNA sembra non amplificarsi correttamente, il processo di risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla la PCR e/o sulle condizioni elettroforetiche. 1. Assenza di picchi di fluorescenza in elettroforesi D N A P C R Possibile causa Templato di DNA insufficiente o degradato Errato protocollo di PCR; Errato programma del termociclatore Azione suggerita Estrarre nuovamente il campione Ricontrollare il protocollo suggerito, seguendo passo per passo la metodica. Eventualmente ripetere il test 2. Picchi di fluorescenza troppo deboli D N A Possibile causa - DNA di scarsa qualità - Presenza di inibitori di PC - Scarsa quantità di templato di DNA Azione suggerita Ricontrollare la metodica di preparazione del campione delle soluzioni, e della loro conservazione Preparare nuovamente il DNA utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Estrarre nuovamente il campione P C R Protocollo di PCR non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test 3. Picchi di fluorescenza troppo intensi durante l elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire il DNA ed effettuare l amplificazione P C R Utilizzato un programma non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Eccessiva quantità di PCR caricata sul sequenziatore 4. Picchi di fluorescenza aspecifici Diluire la PCR ed effettuare nuovamente la corsa elettroforetica Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire la quantità di DNA utilizzata per la PCR P C R Eccessiva quantità di PCR caricata sul Diluire la quantità di PCR da caricare nel sequenziatore sequenziatore 10 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human

11 Referenze The genetics of deafness. Walter E. Nance. Mental retardation and developmental disabilities research : , [2] Molecular genetics of hearing impairment due to mutations in gap junction genes encoding beta connexins. Rabionet R, Gasparini P, Estivill X. Hum Mutat Sep;16(3): , [3] Pathogenetic role of the deafness-related M34T mutation of Cx26. Bicego M, Beltramello M, Melchionda S, Carella M, Piazza V, Zelante L, Bukauskas FF, Arslan E, Cama E, Pantano S, Bruzzone R, D'Andrea P, Mammano F. Hum Mol Genet Sep 1;15(17): Orga Bio Human S.r.l. Sede Legale Via Helsinki Roma Tel , Fax Sede Operativa Via Amsterdam Roma Tel , Fax Web Simboli Utilizzati Codice prodotto Numero di lotto Data d iscadenza Numero di reazioni Precauzioni Versione Fabbricante Temperatura di conservazione 11 CX26-CX30 Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human