RECK controllo interno di qualità dell'rna estratto

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1 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO pag. 1 CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 3 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 PROCEDURA pag. 5 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 9 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 10 USO PREVISTO Il prodotto trova impiego nel controllo di idoneità dell'rna estratto da campioni biologici nei saggi di trascrizione inversa ed amplificazione. Il prodotto inoltre facilita le procedure analitiche nei saggi di trascrizione inversa ed amplificazione. L'identificazione dei campioni non idonei nei saggi di amplificazione per la ricerca di un cdna bersaglio nel prodotto della reazione di trascrizione inversa ottenuto dall'rna estratto da campioni biologici può essere utilizzata per l'accertamento dei campioni veri negativi. PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: C Il prodotto fornisce il controllo di estrazione di RNA CPE-RNA e la miscela di controllo, aliquotati in provette e pronti all'uso. La procedura prevede l'impiego del controllo di estrazione di RNA nella fase di estrazione e della miscela di controllo nella fase di amplificazione. Nella prima fase il CPE-RNA, una soluzione stabilizzata di RNA genomico di fago MS2, è aggiunto dopo il campione al sistema di estrazione in modo da fornire il controllo interno. Il CPE-RNA è estratto e retrotrascritto insieme all'rna del campione. Nella seconda fase il, utilizzato come diluente dell'enzima Taq DNA polimerasi, è aggiunto alla reazione di amplificazione per il parametro in analisi. Il fornisce gli oligonucleotidi di innesco per la coamplificazione della regione genomica che codifica per la proteina di assemblaggio del cdna di fago MS2. La presenza del prodotto specifico della reazione di amplificazione del CPE-RNA indica la correttezza dell'esecuzione dell'estrazione, della trascrizione inversa e dell'amplificazione. Il permette inoltre di verificare visivamente l'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di amplificazione grazie alla sua colorazione e di caricare direttamente il prodotto della reazione di amplificazione su gel di agaroso grazie alle sue caratteristiche di densità e di colorazione. CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO Il può essere utilizzato sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di una sola reazione di amplificazione (single round) sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested). Il può essere utilizzato in reazioni di amplificazione il cui prodotto specifico sia una molecola di DNA di dimensioni inferiori a 500 bp. Il può essere utilizzato in reazioni di amplificazione la cui temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco (annealing) sia compresa tra i 50 C e i 60 C. Il è calibrato in modo da non modificare la sensibilità della reazione di amplificazione. Quando utilizzato con i prodotti della serie OligoMIX, la sensibilità della reazione di amplificazione rimane di circa 10 molecole di cdna bersaglio nei 10 µl di prodotto della reazione di trascrizione inversa aggiunti alla provetta «monotest». Il prodotto consente di effettuare il controllo di idonetà di 50 estrazioni e di 100 reazioni di amplificazione totali (100 single round o 50 nested), controlli positivi e negativi compresi. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione dell RNA dai campioni da analizzare, per la trascrizione inversa dell RNA, per l'amplificazione, per il controllo di amplificazione e per la rivelazione del DNA amplificato non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori prodotti da ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (codice EXTG01), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni non cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni; «EXTRAzol» (codice EXTR01), kit di estrazione dell RNA da campioni cellulari e non cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni; «RT-kit plus» (codice BRK200), kit di trascrizione inversa dell RNA con random primer ; il kit consente di effettuare 50 reazioni; «DNA pol. 2U / µl» (codici ER40, ER140), enzima DNA polimerasi termostabile per l'amplificazione degli acidi nucleici; il prodotto ER40 consente di effettuare 25 reazioni, il prodotto ER140 consente di effettuare 100 reazioni. serie «OligoMIX Alert kit», kit di amplificazione del cdna prodotto dalla trascrizione inversa dell RNA estratto da campioni biologici; serie «Positive Control», controlli positivi di amplificazione di DNA plasmidico; serie «ELECTROPHORESIS» (codici EPH02 o EPH04), rivelazione del DNA amplificato per elettroforesi su gel d agaroso; il kit consente di effettuare 64 estrazioni. SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 1/10 SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 2/10

2 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura CPE-RNA controllo di estrazione di RNA 4 x 150 µl miscela di controllo 4 x 200 µl ~3 fm RNA genomico MS2, BSA acetilata, Guanidina tiocianato, Sodio laurilsarcosinato, 100 mm 2-Mercaptoetanolo, Sodio citrato, Acido Cloridrico Poliacrilamide lineare 0,1 µm oligonucleotidi TRIS-HCl, saccaroso, Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO Xn - NOCIVO - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso in lattice o simili. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile (thermal - cycler). AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori. - Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Il reagente CPE-RNA presenta le seguenti frasi di rischio (R) e i seguenti consigli di prudenza (S): Xn - NOCIVO R 20/21/ Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con la pelle libera gas altamente tossico. S Non mangiare né bere durante l'impiego. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Usare guanti adatti. Non mescolare con acidi. Il reagente presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 3/10 SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 4/10

3 Impostazione del ciclo termico PROCEDURA - verificare che i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione principale prevedano una temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco (annealing) compresa tra i 50 C e i 60 C - impostare ; sul thermal - cycler i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione principale. Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica ai parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione. Campioni Il materiale da utilizzare con questo prodotto deve essere costituito dal prodotto della reazione di trascrizione inversa (cdna) ottenuto dall RNA estratto da campioni biologici. Il sistema di trascrizione inversa dell'rna deve utilizzare i "random primer" per l'innesco della reazione di polimerizzazione. Quando si impiegano campioni biologici cellulari, per esempio sangue intero, si consiglia di verificare la quantità di RNA totale estratto che è immessa nella reazione di trascrizione inversa, per evitare la comparsa di prodotti aspecifici e possibili fenomeni di inibizione nella successiva reazione di amplificazione. La concentrazione finale massima dell RNA totale nella reazione di trascrizione inversa dovrebbe essere di circa 40 ng / µl. Per esempio, la quantità massima di RNA totale che può essere immessa in una reazione di trascrizione inversa con volume finale di 25 µl è di circa 1 µg. Il sistema di estrazione dell'rna dal campione di partenza deve fornire RNA idoneo all'uso in reazioni di trascrizione inversa ed amplificazione. Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti. Controlli di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di estrazione ed amplificazione allestendo un controllo negativo e un controllo. Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al posto del campione biologico senza aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione. Per il controllo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al posto del campione biologico e aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione. Allestimento dell'estrazione - scongelare una provetta di CPE-RNA, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio. Nota bene: Il CPE-RNA deve essere utilizzato nella prima fase della procedura di estrazione. Dopo l'aggiunta del campione alla soluzione lisante, aggiungere 10 µl di CPE-RNA a ciascuna provetta di estrazione e mescolare per inversione. Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di estrazione. Allestimento della trascrizione inversa Il sistema di trascrizione inversa deve utilizzare oligonucleotidi a sequenza casuale "random primer" come innesco della reazione di polimerizzazione del cdna. Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di retrotrascrizione. Allestimento dell'amplificazione - scongelare una provetta di, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio. - diluire l enzima DNA polimerasi termostabile (non fornita nel prodotto) con il alla concentrazione finale desiderata. Preparare un volume di enzima diluito sufficiente per tutte le reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un margine di sicurezza. L enzima diluito non può essere conservato. Nota bene: Il volume di aggiunto alla reazione di amplificazione con l enzima diluito deve risultare un decimo del volume finale della reazione di amplificazione stessa. Aggiungere a ciascuna provetta di amplificazione 5 µl di DNA polimerasi termostabile diluita nel (quando il volume finale di reazione è di 50 µl). Nota bene: L'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di amplificazione può essere verificata visivamente grazie alla colorazione blu del. Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di amplificazione. Nota bene: Quando il è utilizzato con sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested) deve essere utilizzato per la diluizione dell'enzima DNA polimerasi termostabile sia nell'allestimento della prima amplificazione sia nell'allestimento della seconda amplificazione. Allestimento della rivelazione elettroforetica su gel di agaroso Il prodotto specifico della reazione di amplificazione può essere rivelato ed identificato mediante separazione elettroforetica nelle condizioni descritte di seguito: - utilizzando un gel d'agaroso al 2% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TBE 1x (89 mm TRIS, 89 mm acido borico, 2 mm EDTA disodico); - utilizzando un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TAE 1x (40 mm TRIS, 20 mm acido acetico, 1 mm EDTA disodico), come nei prodotti della serie «ELECTROPHORESIS». Nota bene: Il elimina la necessità di preparare il prodotto della reazione di amplificazione mediante l'aggiunta di un tampone di caricamento grazie alla sua densità e colorazione. Prelevare 15 µl di prodotto della reazione di amplificazione e trasferirli direttamente in un pozzetto del gel di agaroso. Il prodotto specifico della amplificazione del CPE-RNA ha dimensioni di circa 610 bp. Nota bene: La corsa elettroforetica deve essere eseguita in modo da risolvere il prodotto specifico della reazione di amplificazione del parametro in analisi dal prodotto specifico del CPE-RNA. Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di rivelazione. Nota bene: Il prodotto della reazione di amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare il prodotto della reazione di amplificazione residuo e gli scarti prodotti nella fase di rivelazione. SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 5/10 SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 6/10

4 A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta il risultato della separazione elettroforetica di una sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione in cui sono stati analizzati quattro campioni. La reazione di amplificazione per il parametro in analisi presenta un prodotto specifico di 235 bp. Pozzetti 1380 bp Pesi Molecolari parametro in analisi negativo generale negativo idoneo 517 bp 459 bp 610 bp 610 bp 610 bp 387 bp 247 bp 75 bp 65 bp 46 bp * 235 bp 235 bp 235 bp non idoneo * I campioni positivi per il parametro in analisi, pur essendo idonei, possono non presentare il prodotto della reazione di amplificazione del CPE-RNA. Infatti la reazione di amplificazione del CPE-RNA con il può essere spostata dalla reazione di amplificazione del parametro in analisi. E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della reazione di amplificazione di un campione confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione di un marker di peso molecolare e con la migrazione del prodotto della reazione di amplificazione del controllo. L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della reazione di amplificazione non ha alcun significato per quanto riguarda la ricerca del cdna del CPE-RNA nel campione. Interpretazione dei risultati Prima di convalidare definitivamente un risultato "cdna del parametro in analisi ASSENTE" per un campione è necessario analizzare il risultato ottenuto con il per questo campione. I risultati delle reazioni relative ai campioni in analisi sono utilizzati per valutare la presenza del cdna del CPE-RNA come descritto nella tabella seguente: Risultato del saggio cdna del CPE-RNA Idoneità del campione Prodotto specifico ASSENTE negativo ASSENTE non idoneo* Prodotto specifico PRESENTE PRESENTE idoneo, vero negativo Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di un campione in analisi, si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o nulla) o nella fase di trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o nulla) o nella fase di estrazione (assenza di RNA o presenza di inibitori) che possono causare risultati falsi negativi. Il campione è NON IDONEO e l'analisi deve essere ripetuta a partire dall estrazione di un nuovo campione. *Nota bene: Quando nella reazione di amplificazione è presente il prodotto specifico per il parametro in analisi, il prodotto specifico del CPE-RNA può risultare assente. Infatti la reazione di amplificazione del CPE-RNA con il, essendo calibrata per non interferire, può essere spostata dalla reazione di amplificazione per il parametro in analisi. In questo caso il campione è comunque idoneo e il risultato dell'analisi è valido. Convalidazione generale della sessione di amplificazione I risultati delle reazioni di controllo negativo e di controllo sono utilizzati per convalidare la sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione come descritto nelle tabelle seguenti: Amplificazione del controllo negativo Prodotto specifico ASSENTE Amplificazione del controllo Prodotto specifico PRESENTE Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione corretta Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione corretta Se il prodotto specifico di amplificazione è presente nella reazione di controllo negativo, si sono verificati problemi di contaminazione nella fase di estrazione, di trascrizione inversa o di amplificazione che possono causare risultati falsi positivi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di estrazione. Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di controllo, si sono verificati problemi nella fase di estrazione (assenza di RNA o presenza di inibitori), nella fase di trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o assente) o nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o assente) che possono causare risultati falsi negativi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di estrazione. SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 7/10 SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 8/10

5 PROBLEMI E SOLUZIONI LEGENDA DEI SIMBOLI Prodotto specifico di amplificazione presente nella reazione di controllo negativo Possibili cause Errore durante la dispensazione del CPE-RNA Errore durante la dispensazione dell'rna estratto Errore durante la dispensazione del cdna di prima amplificazione Contaminazione dei reagenti preparati per la sessione Contaminazione dell'acqua sterile o del per la diluizione degli enzimi Contaminazione degli stock di enzimi Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione Soluzioni Eseguire con attenzione la ricostituzione, la diluizione e la dispensazione dei reagenti, cambiare sempre puntale Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile o di Utilizzare nuove aliquote di enzimi Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso Prodotto specifico di amplificazione assente nella reazione di Positive Control Possibili cause Soluzioni Errore durante la dispensazione del CPE-RNA Eseguire con attenzione la dispensazione del CPE-RNA CONT Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dis medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Errore durante la dispensazione dell'rna estratto Errore durante la dispensazione del cdna Eseguire con attenzione la dispensazione dell'rna Eseguire con attenzione la dispensazione del cdna Fabbricante. di prima amplificazione della reazione di amplificazione nel gel Errore durante l'estrazione dell'rna Prelevare e dispensare con attenzione il prodotto di prima amplificazione nella seconda amplificazione Caricare con attenzione il prodotto della reazione di amplificazione nel gel Seguire con attenzione le istruzioni relative all'estrazione dell'rna. Sistema di trascrizione inversa non adatto Utilizzare un sistema con random primer. Enzimi troppo diluiti o errore durante la dispensazione degli enzimi Ricontrollare i calcoli di diluizione, seguire con attenzione la dispensazione degli enzimi e mescolare adeguatamente Degradazione del controllo Errore di impostazione dei cicli termici Utilizzare una nuova aliquota di CPE-RNA Controllare i cicli termici impostati sul thermal cycler. Temperatura di annealing superiore a 60 C SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 9/10 SCH m 28/05/13 Revisione 02 Pag. 10/10