AVVERTENZA del 18/06/15. «EXTRAgen» cod. EXTG01

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1 AVVERTENZA del 18/06/15 IMPORTANTE PER GLI UTILIZZATORI DEL PRODOTTO: cod. ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: Sono state apportate delle modifiche al Manuale d Istruzioni per l Uso (IFU), SCH m, riguardanti la classificazione e l etichettatura delle sostanze/miscele contenute nel kit, come previsto dal Regolamento n. 1272/2008 (CLP) e s.m.i. Tutte le modifiche introdotte sono riportate dettagliatamente nel Manuale d Istruzioni per l Uso (IFU) allegato e nelle Schede dati di Sicurezza relative al prodotto. Il principio analitico e i reattivi del test restano del tutto invariati. NOTA BENE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT (vedi Package Insert incluso nel kit) THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT (see Package Insert included in the kit) CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT (voir Package Insert inclus dans le kit) LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT (véa Package Insert incluido en el kit) A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT (ver Package Insert incluído no kit) DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT (Sehen Sie Package Insert im Kit enthalten) Accessori e kit degli strumenti Strumenti per l estrazione automatica e l amplificazione si accompagnano all utilizzo di accessori e/o kit indicati nel Manuale d Istruzione per l Uso nella sezione Altri prodotti richiesti. La richiesta di tali prodotti deve essere espressamente indicata nell ordine d acquisto relativo al presente kit di amplificazione. Avvertenza nr. SCH m_04 del 18/06/15

2 SOMMARIO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: +2 C +8 C USO PREVISTO pag. 1 PRINCIPIO DELLA METODICA pag. 2 DESCRIZIONE DEL KIT pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT pag. 3 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 CAMPIONI E CONTROLLI pag. 5 PROCEDURE pag. 6 LIMITI DELLA PROCEDURA pag. 10 CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI pag. 11 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 13 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 14 PRINCIPIO DELLA METODICA Il prodotto è una metodica di estrazione del DNA e dell'rna con lisi in guanidina. La procedura prevede quattro fasi operative: - la lisi del campione (circa 15 minuti) nel reagente di estrazione con un agente caotropico (guanidina idrocloruro), un detergente (CTAB) e un agente riducente (2-mercaptoetanolo); - la precipitazione ad alta temperatura delle proteine, la loro separazione per centrifugazione e la loro eliminazione (circa 30 minuti); - la precipitazione degli acidi nucleici con etanolo e un coprecipitante inerte (poliacrilamide lineare) e il loro recupero per centrifugazione (circa 15 minuti); - il lavaggio del deposito di acidi nucleici e il suo discioglimento nell'acqua ultrapura (circa 30 minuti). La metodica del sistema di estrazione è una tecnologia di proprietà di ELITechGroup S.p.A. ed è coperta dal brevetto DESCRIZIONE DEL KIT Il kit fornisce i seguenti componenti: - il Reagente per l'estrazione, prealiquotato in 50 Provette di Estrazione pronte all'uso. Ogni provetta contiene 800 µl di soluzione, - le Provette di Precipitazione, 50 provette vuote da 2,0 ml per biologia molecolare, - il Reagente di Lavaggio, 15 ml di soluzione da ricostituire con l'aggiunta di 45 ml di Etanolo assoluto, - l'acqua Ultrapura, per biologia molecolare, prealiquotata in 2 provette contenenti 1900 µl. Il kit consente di effettuare 50 estrazioni, controlli positivi e negativi compresi. MATERIALE INCLUSO NEL KIT Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura Reagente Provette di Estrazione da 1,5 ml, pronte all'uso 50 x 800 µl Guanidina idrocloruro, CTAB, 2-Mercaptoetanolo, Sodio Cloruro, Sodio Acetato, Acido Acetico, Poliacrilamide lineare GHS07 Attenzione USO PREVISTO Provette di Precipitazione Provette da 2,0 ml, vuote, per biologia molecolare Il prodotto è un sistema di estrazione del DNA e dell'rna virale contenuto nelle particelle virali libere presenti in campioni di fluidi non cellulari quali plasma raccolto in EDTA, siero, liquido cefalorachidiano, liquido amniotico, urine, sovranatante da gargarizzato, da tampone faringeo, da tampone nasale, da latte materno, da colture cellulari e da feci. Il prodotto trova impiego nell'estrazione del DNA e dell'rna da campioni di fluidi non cellulari. Il DNA e l'rna estratti possono essere utilizzati per saggi diagnostici basati sull'amplificazione degli acidi nucleici con enzimi DNA polimerasi (per esempio trascrittasi inversa e DNA polimerasi termostabili). Reagente di Lavaggio Soluzione di lavaggio, da ricostituire con 45 ml di Etanolo assoluto 15 ml - - Acqua Ultrapura Acqua per biologia molecolare 2 x 1,9 ml - - SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.1/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.2/14

3 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT - Etanolo assoluto (purissimo per analisi, ACS o equivalente). - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Provette in polipropilene sterili da microcentrifuga (1,5 ml). - Tubi in polipropilene sterili da centrifuga (50 ml). - Miscelatore tipo vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Termostato a secco a + 80 C con blocco termico per provette da microcentrifuga da 1,5 ml. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per il controllo positivo di estrazione non sono inclusi in questo kit. Per poter eseguire questa procedura analitica si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori di ELITechGroup S.p.A.: «CPE - Internal Control» (codice CTRCPE), una soluzione stabilizzata contenente due DNA plasmidici e RNA genomico di fago MS2 per il Controllo Interno di estrazione ed inibizione per la ricerca degli acidi nucleici in campioni cellulari e non cellulari. «CPE-RNA - Internal Control» (codice CTRRNA, oppure incluso nel «RECK», codice RK100), controllo positivo di estrazione di RNA di fago per sistemi di estrazione dell'rna da campioni non cellulari; il prodotto consente di effettuare 50 estrazioni. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo kit è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere attentamente le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non utilizzare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotto di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale competente e addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Non introdurre mai un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Non trasferire mai camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Il seguente componente dell contiene reagenti pericolosi. Le frasi di Rischio e Sicurezza della Comunità Europea e le frasi di Pericolo e Precauzioni GHS applicate a questo componente sono elencate qui di seguito. Da notare che l'etichettatura dei rischi non è necessaria se la quantità per flacone è inferiore a 125 g o a 125 ml. Reagente Attenzione GHS07 H315: Provoca irritazione cutanea. H319: Provoca grave irritazione oculare. P264: Lavare accuratamente le mani dopo l uso. P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/proteggere il viso. P302+P352: IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone. P305+P351+P338: IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P321: Trattamento specifico. P332+P313: In caso di irritazione della pelle, consultare un medico. P337+P313: Se l'irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. P362+P364: Togliere gli indumenti contaminati e lavarli prima di indossarli nuovamente. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.3/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.4/14

4 CAMPIONI E CONTROLLI PROCEDURE Campioni Con questo kit possono essere utilizzati i seguenti fluidi non cellulari: - plasma raccolto in EDTA, vedi pagina 6/14; - siero, vedi pagina 6/14; - liquido cefalorachidiano, vedi pagina 6/14; - liquido amniotico, vedi pagina 6/14; - urina, vedi pagina 6/14; - sovranatante da gargarizzato, vedi pagina 7/14; - sovranatante da tampone faringeo, vedi pagina 7/14; - sovranatante da tampone nasale, vedi pagina 7/14; - sovranatante da latte materno, vedi pagina 7/14; - sovranatante da colture cellulari, vedi pagina 7/14; - sovranatante da feci, vedi pagina 8/14. I campioni devono essere costituiti da fluidi non cellulari in cui gli acidi nucleici siano contenuti nelle particelle virali libere. Il volume del campione da estrarre deve essere di 300 µl. Quando si intende estrarre un campione di volume inferiore a 300 µl portare il campione a 300 µl aggiungendo Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile. Per gli utilizzatori di saggi di amplificazione quantitativi, per esempio i prodotti tipo "Amplificazione Real Time Duplex" e "Real Time PCR Duplex Monoreagente", si consiglia di prendere sempre nota del volume di campione utilizzato in estrazione e del volume di acqua ultrapura utilizzato per disciogliere gli acidi nucleici in modo da poter eseguire i calcoli per il dosaggio del parametro in analisi. Le provette in cui si trasferiscono aliquote dei campioni da estrarre devono sempre essere marcate in modo riconoscibile con un pennarello indelebile. Per una conservazione ottimale dei campioni si consiglia di suddividerli in più aliquote (volume minimo 300 µl) e di congelarli a -20 C per un massimo di trenta giorni o a -70 C per tempi più lunghi. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Quando si utilizzano campioni congelati, scongelare i campioni subito prima dell'inizio dell'estrazione per evitare eventuali fenomeni di degradazione degli acidi nucleici. Sostanze interferenti I campioni di plasma non devono contenere eparina che è un potente inibitore degli enzimi DNA polimerasi (per esempio trascrittasi inversa e DNA polimerasi termostabili) e causa risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti. I campioni non devono contenere Ficoll, destrano o emoglobina che possono inibire degli enzimi DNA polimerasi (per esempio trascrittasi inversa e DNA polimerasi termostabili) e causare risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti. Eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci che possono essere presenti nel campione di partenza andranno valutati di volta in volta sulla base dell'uso che sarà fatto del prodotto di estrazione. Controlli di qualità E' consigliato convalidare l'intera procedura di analisi di ciascuna sessione di estrazione utilizzando un campione negativo e un campione positivo. Come campione negativo, utilizzare un campione negativo già testato per il parametro di interesse oppure eseguire un'estrazione simulata con acqua bidistillata sterile al posto del campione. Come campione positivo, utilizzare un campione positivo già testato per il parametro di interesse oppure del materiale di riferimento certificato. Ricostituzione del Reagente di Lavaggio (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) Prima di iniziare la sessione di estrazione dei campioni, ricostituire il Reagente di Lavaggio aggiungendo nella bottiglia 45 ml di Etanolo assoluto (Attenzione: l'etanolo assoluto è infiammabile, non fornito nel kit) e segnando l'operazione sull'apposita casella sull'etichetta. Il Reagente di Lavaggio ricostituito può essere conservato a +2 / +8 C per un anno. Raccolta, trasporto, conservazione, pretrattamento dei campioni (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) Plasma raccolto in EDTA Attenzione: i campioni biologici possono trasmettere agenti infettivi. I campioni di plasma destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti in EDTA secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di plasma non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Siero I campioni di siero destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di siero non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Liquido cefalorachidiano I campioni di liquido cefalorachidiano destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio evitando la contaminazione con il sangue del paziente, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di liquido cefalorachidiano non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Liquido amniotico I campioni di liquido amniotico destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio evitando la contaminazione con il sangue materno, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di liquido amniotico non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Urina I campioni di urina destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti in contenitori senza conservanti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a temperatura ambiente (+ 18 / + 25 C) e conservati a temperatura ambiente (+ 18 / + 25 C) per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. Il congelamento dei campioni di urina causa spesso la formazione di precipitati che possono interferire con le fasi successive della metodica: per l'estrazione utilizzare solo il sovranatante. I campioni di urina non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.5/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.6/14

5 Gargarizzato I campioni di gargarizzato destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere preparati secondo le indicazioni del laboratorio in Soluzione fisiologica sterile, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di gargarizzato non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Tampone faringeo e tampone nasale I campioni da tampone faringeo o da tampone nasale destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere preparati secondo le indicazioni del laboratorio, stemperati in mezzo di trasporto per colture cellulari o Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. a b c Trasferire in un tubo in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml fino a 1 ml di tampone faringeo o di tampone nasale stemperati. Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. Prelevare con attenzione 300 µl del sovranatante e procedere all estrazione. Il volume rimanente di sovranatante può essere conservato aliquotato a - 20 C o a -70 C. Latte materno I campioni di latte materno destinato all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. a b c Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml fino a 1 ml di latte materno. Centrifugare a temperatura ambiente per 10 minuti a RPM. Prelevare con attenzione 300 µl della fase liquida sierosa e procedere all estrazione. Il volume rimanente della fase liquida sierosa può essere conservato aliquotato a - 20 C o a -70 C. Sovranatante di coltura cellulare I campioni di sovranatante di coltura cellulare destinati all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. I campioni di sovranatante di coltura cellulare non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione. Sovranatante fecale I campioni di feci destinate all'estrazione del DNA e dell'rna devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. a b c d e f Trasferire in un tubo in polipropilene sterile da 15 ml 10 ml di Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile. Trasferire nel tubo circa 1 grammo di feci e mescolare su vortex per 15 secondi. Centrifugare a temperatura ambiente per 10 minuti a RPM. Trasferire con attenzione in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml 1 ml di sovranatante. Centrifugare a temperatura ambiente per 10 minuti a RPM. Prelevare 300 µl del sovranatante e procedere all estrazione. Il volume rimanente del sovranatante può essere conservato aliquotato a - 20 C o a -70 C. Allestimento dell'estrazione (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) Prima di iniziare la sessione è necessario: - impostare il termostato a secco con blocco a fori conici per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a +80 C e attendere che raggiunga la temperatura di lavoro. Se fosse disponibile solo un termostato a secco con blocco con fori cilindrici aggiungere dell'acqua nei fori in modo da garantire un trasferimento ottimale di calore; - scongelare le provette di «CPE - Internal Control» o di «CPE-RNA - Internal Control» necessarie per la sessione ricordando che il contenuto di ciascuna provetta è sufficiente per effettuare 14 estrazioni. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio. - prelevare le Provette di Estrazione, una per ciascuno dei campioni da analizzare, una per il controllo positivo e una per il controllo negativo, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile; - prelevare tante Provette di Precipitazione quante sono le Provette di Estrazione e marcarle allo stesso modo con un pennarello indelebile; - preparare in un tubo di polipropilene sterile da 50 ml (non fornito nel kit) un'aliquota di Etanolo assoluto (Attenzione: l'etanolo assoluto è infiammabile, non fornito nel kit) trasferendo 1 ml di etanolo assoluto per ciascuno dei campioni da analizzare e ancora 1 ml per avere un margine di sicurezza; marcare il tubo in modo riconoscibile con un pennarello indelebile; - preparare un tubo di polipropilene sterile da 50 ml (non fornito nel kit) da utilizzare per gli scarti liquidi dell'estrazione e marcarlo in modo riconoscibile con un pennarello indelebile; - prelevare la bottiglia del Reagente di Lavaggio e verificare che sia già stato ricostituito. Estrazione (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) 1. Trasferire 300 µl del campione (Attenzione: i campioni biologici possono trasmettere agenti infettivi) nella Provetta di Estrazione con il Reagente, aggiungere 5 µl di «CPE - Internal Control» o 10 µl di «CPE-RNA - Internal Control» alla Provetta di Estrazione, mescolare immediatamente per inversione per alcune volte e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. 2. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 secondi a RPM. 3. Sistemare la provetta nel blocco termico (Attenzione: il blocco termico è caldo) e incubare per 10 minuti a +80 C. 4. Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a RPM. 5. Durante la centrifugazione, trasferire 900 µl di Etanolo assoluto (Attenzione: l'etanolo assoluto è infiammabile, non fornito nel kit) nella Provetta di Precipitazione da 2 ml vuota fornita nel kit. 6. Prelevare dalla Provetta di Estrazione 900 µl di sovranatante prestando attenzione a non aspirare nel puntale proteine precipitate o lipidi eventualmente presenti in superficie o sulle pareti. Trasferire il sovranatante nella Provetta di Precipitazione con l'etanolo assoluto e mescolare immediatamente invertendo una decina di volte. 7. Centrifugare* la Provetta di Precipitazione a temperatura ambiente per 10 minuti a RPM per raccogliere gli acidi nucleici sul fondo della provetta. *Nota Bene: Posizionare le provette nella microcentrifuga con la cerniera del tappo rivolta verso l'esterno in modo da poter identificare la parete su cui si sarà formato il deposito di acidi nucleici. 8. Scartare il sovranatante versandolo con cura in un tubo di polipropilene da 50 ml (non fornito nel kit). Asciugare la goccia di sovranatante sul bordo della Provetta di Precipitazione tamponandola con carta bibula pulita. Non eliminare subito il tubo di polipropilene con gli scarti perché sarà ancora utilizzato in seguito. Nota Bene: Il deposito di acidi nucleici sul fondo della provetta è spesso invisibile in questa fase delle operazioni di estrazione. 9. Trasferire 1 ml di Reagente di Lavaggio (già ricostituito) nella Provetta di Precipitazione con il deposito di acidi nucleici e invertire per una decina di volte. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.7/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.8/14

6 10. Centrifugare* la Provetta di Precipitazione a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. *Nota Bene: Posizionare le provette nella microcentrifuga con la cerniera del tappo rivolta verso l'esterno in modo da poter identificare la parete su cui si sarà formato il deposito di acidi nucleici. 11. Prelevare il sovranatante con una pipetta per grossi volumi prestando attenzione a non aspirare nel puntale il deposito di acidi nucleici ora visibile sul fondo della provetta. Trasferire il sovranatante nel tubo con gli scarti (vedi punto 8). 12. Centrifugare* la Provetta di Precipitazione a temperatura ambiente per 5 secondi a RPM. *Nota Bene: Posizionare le provette nella microcentrifuga con la cerniera del tappo rivolta verso l'esterno in modo da poter identificare la parete su cui si sarà formato il deposito di acidi nucleici. 13. Prelevare completamente il sovranatante con una pipetta per piccoli volumi prestando attenzione a non aspirare nel puntale il deposito di acidi nucleici. Trasferire il sovranatante nel tubo con gli scarti (vedi punto 8). Tenere chiuso il tubo con gli scarti fino al momento dell'eliminazione nei rifiuti speciali. 14. Lasciare asciugare la provetta per almeno 5 minuti sotto una cappa a flusso laminare. 15. Disciogliere il deposito di acidi nucleici nell'appropriato volume di Acqua ultrapura, come descritto nella tabella seguente: Acido nucleico Volume di Acqua ultrapura Consigliato per RNA 15 µl reazione di trascrizione inversa con prodotto «RT - kit plus» DNA 15 µl prodotti serie «AMPLIFICAZIONE NESTED» prodotti serie «AMPLIFICAZIONE REAL TIME DUPLEX» DNA 60 µl prodotti serie «REAL TIME PCR DUPLEX MONOREAGENTE» Procedura per disciogliere il deposito di acidi nucleici nell'acqua ultrapura: - scaricare l'acqua ultrapura sulla parete della provetta dalla parte della cerniera del tappo; - farla scivolare fino al fondo della provetta sul deposito di acidi nucleici; - lasciare reidratare il deposito di acidi nucleici a temperatura ambiente per 5 minuti; - agitare energicamente per sciogliere il deposito sul fondo e sulla parete della provetta; - centrifugare a temperatura ambiente per 5 secondi per riportare sul fondo della provetta gli acidi nucleici estratti. Nota Bene: I volumi di Acqua ultrapura consigliati nella tabella permettono di ottenere la massima sensibilità nei successivi saggi diagnostici e di eseguire due saggi con gli acidi nucleici estratti. Nota Bene: Gli acidi nucleici estratti possono essere conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni oppure a -70 C per tempi più lunghi. Nota bene: Gli acidi nucleici estratti sono in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare o smaltire in modo appropriato gli acidi nucleici estratti residui e gli scarti prodotti nelle manipolazioni successive. LIMITI DELLA PROCEDURA Utilizzare con questo prodotto soltanto i seguenti campioni umani: plasma raccolto in EDTA, siero, liquido cefalorachidiano, liquido amniotico, urine, sovranatante da gargarizzato, da tampone faringeo, da tampone nasale, da latte materno, da colture cellulari e da feci. Non utilizzare con questo prodotto campioni di plasma raccolti in eparina: l'eparina inibisce gli enzimi DNA polimerasi (per esempio trascrittasi inversa e DNA polimerasi termostabili) e causa risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti. Non utilizzare con questo prodotto campioni contenenti Ficoll, destrano o emoglobina: queste sostanze possono inibire gli enzimi DNA polimerasi (per esempio trascrittasi inversa e DNA polimerasi termostabili) e causare risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti. Eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci che possono essere presenti nel campione di partenza andranno valutati di volta in volta sulla base dell'uso che sarà fatto del prodotto di estrazione. I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta identificazione, raccolta, trasporto, conservazione e preparazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite. Questo prodotto richiede personale competente e addestrato alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e aree di lavoro adeguate alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede personale competente e addestrato per le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici per evitare risultati errati nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle fasi successive delle analisi condotte sugli acidi nucleici estratti con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.9/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.10/14

7 Efficienza di estrazione CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Questo sistema di estrazione permette di utilizzare fino a 300 µl di campione costituito da fluido biologico non cellulare e di recuperare in media l'80% del DNA e dell'rna presente in partenza. L'efficienza della metodica di estrazione, come capacità di rendere disponibile il DNA o l'rna virale del campione, è stata verificata nelle validazioni dei prodotti ELITechGroup S.p.A. utilizzando campioni clinici positivi per i seguenti virus: CMV, HSV1, HSV2, EBV, VZV, HHV6, HHV8, BKV, JCV, Enterovirus, virus Influenza A, virus Influenza B, RSV. A titolo di esempio si riportano alcuni dati relativi ad un virus con genoma ad RNA, Enterovirus, e ad un virus con genoma ad DNA, CMV. Nel caso del virus con genoma ad RNA, le prove sono state eseguite utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni di diversi Enterovirus entro la concentrazione limite (QCMD 2007 Enterovirus and parechovirus Proficiency Panel, Qnostics Ltd, Scozia, Regno Unito). Ciascun campione del pannello è stato impiegato in 2 replicati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione, trascrizione inversa e amplificazione real time, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e gli accessori. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Estrazione di pannello per proficiency test Campione Genotipo e titolo teorico Risultato Media dei risultati Positivi / Replicati (TCID 50 / 0,05 ml) atteso Log 10 geq / ml EV07-01 Coxsackievirus B3, / 2 5,122 EV07-02 Parechovirus 3, 5,6 + 0 / 2 - EV07-03 Echovirus 11, 0,13 +/- 2 / 2 2,160 EV07-04 Echovirus 11, 1,3 + 2 / 2 3,053 EV07-05 Negativo, NA - 0 / 2 - EV07-06 Enterovirus 71, 2, / 2 4,878 EV07-07 Coxsackievirus B3, 5, / 2 3,956 EV07-08 Echovirus 30, 2, / 2 4,835 EV07-09 Echovirus 30, 0, / 2 3,910 EV07-10 Poliovirus 3, 0,063 +/- 2 / 2 2,769 EV07-11 Parechovirus 3, 0,056 +/- 0 / 2 - EV07-12 Coxsackievirus B3, 0,5 + 2 / 2 2,626 Tutti i campioni sono stati identificati correttamente. I risultati quantitativi per questo pannello non sono stati elaborati da QCMD. Nel caso del virus con genoma a DNA, le prove sono state eseguite utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni di CMV (ceppo AD169) entro la concentrazione limite (QCMD 2007 Human Cytomegalovirus Proficiency Panel, Qnostics Ltd, Scozia, Regno Unito). Ciascun campione del pannello è stato impiegato in 2 replicati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione real time, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e gli accessori. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Campione Consensus dei sistemi commerciali Log 10 conc. virale Estrazione di pannello per proficiency test Deviazione Standard Positivi / Replicati Media dei risultati Log 10 geq / ml CMV07-01 CMV, 4,436 0,349 2 / 2 4,355 CMV07-02 CMV, 2,270 0,600 2 / 2 1,583 CMV07-03 Negativo, NA - 0 / 2 - CMV07-04 CMV, 5,413 0,360 2 / 2 5,380 CMV07-05 Negativo, NA - 0 / 2 - CMV07-06 CMV, 2,979 0,360 2 / 2 2,854 CMV07-07 CMV, 6,497 0,448 2 / 2 6,370 CMV07-08 CMV, 3,568 0,341 2 / 2 3,529 CMV07-09 CMV, 1,878 0,768 2 / 2 1,808 CMV07-10 CMV, 2,227 0,456 2 / 2 2,276 Tutti i campioni sono stati identificati correttamente. I risultati quantitativi ottenuti rientrano nell'intervallo definito dal Consensus ± 1 D.S. tranne per il campione CMV Questo campione ha dato un risultato inferiore all'atteso ma la sua concentrazione teorica è al di sotto del limite inferiore dell'intervallo lineare di misurazione (316 geq / ml o 2,5 Log 10 geq / ml) dell'amplificazione real time. L'efficienza della metodica di estrazione, come capacità di recuperare gli acidi nucleici del campione, è stata verificata utilizzando un DNA plasmidico aggiunto a campioni di plasma raccolto in EDTA. Le prove sono state eseguite utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA plasmidico, la cui concentrazione iniziale è stata misurata allo spettrofotometro. Il DNA plasmidico è stato aggiunto a plasma raccolto in EDTA in modo da ottenere campioni con 5 µg di DNA plasmidico in 300 µl. Questi campioni sono stati impiegati in 10 replicati per eseguire la procedura di estrazione. Il DNA plasmidico recuperato è stato risospeso in 100 µl di acqua e quindi è stata eseguita la lettura dell'assorbanza allo spettrofotometro. Il valore dell'assorbanza degli estratti è stata confrontata con quella di 5 µg di DNA plasmidico direttamente diluito in 100 µl di acqua. I risultati ottenuti sono coerenti con un'efficienza di estrazione pari in media all'80%. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Valore di assorbanza del DNA plasmidico direttamente diluito in 100 µl di acqua Valore medio di assorbanza del DNA plasmidico recuperato e risospeso in 100 µl di acqua Efficienza di estrazione 1,01 0,84 83% La purezza del DNA plasmidico recuperato, espressa come media del rapporto dei valori di assorbanza a 260 nm e a 280 nm, è risultata pari a 1,77. Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "", FTP. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.11/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.12/14

8 PROBLEMI E SOLUZIONI LEGENDA DEI SIMBOLI Falsi negativi Possibili cause Degradazione dell'acido nucleico del campione. Precipitazione di sali di estrazione. Assenza del deposito di acidi nucleici. Perdita del deposito di acidi nucleici. Degradazione dell'acido nucleico estratto. Falsi positivi Possibili cause Contaminazione durante l'estrazione dei campioni. Contaminazione dei reagenti preparati per la sessione. Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. Deposito di acidi nucleici difficile da disciogliere Soluzioni Utilizzare un nuovo campione, conservare nel modo adatto i campioni. Eseguire con attenzione il prelievo dei 900 µl di sovranatante dalla provetta di estrazione. Mescolare con attenzione l'etanolo assoluto e il sovranatante nella provetta di precipitazione. Eseguire con attenzione l'aspirazione del reagente di lavaggio per non rimuovere il deposito di acidi nucleici. Utilizzare puntali esenti da DNasi e RNasi, cambiare l'aliquota in uso di etanolo assoluto, reagente di lavaggio, Acqua ultrapura. Soluzioni Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale. Utilizzare nuove aliquote di etanolo assoluto, reagente di lavaggio, Acqua ultrapura. Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso. Possibili cause Soluzioni Fare evaporare tutto il liquido presente nella provetta di Deposito di acidi nucleici lasciato asciugare precipitazione ma non fare seccare il deposito di acidi per tempi troppo lunghi. nucleici. Controllare che il termostato sia a +80 C, rispettare i tempi di incubazione a +80 C, controllare che i fori del blocco Presenza di proteine nel deposito di acidi termico siano adatti alle provette di estrazione, seguire con nucleici. attenzione il trasferimento del sovranatante nella provetta di precipitazione. Attraversare con il puntale lo strato di lipidi eventualmente presente in superficie, eseguire con attenzione il Presenza di lipidi nel deposito di acidi nucleici. trasferimento del sovranatante nella provetta di precipitazione. CONT Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuti. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.13/14 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag.14/14