RACCOLTA E PROCESSAMENTO CAMPIONE URINE PER ANALISI OMICHE

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Vittorio Cavallaro
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RACCOLTA E PROCESSAMENTO CAMPIONE URINE PER ANALISI OMICHE 00049 Autori

1 RACCOLTA E PROCESSAMENTO CAMPIONE URINE PER ANALISI OMICHE Autori Vittorio Sirolli Contenuti Abstract raccolta e processamento dei campioni urinari

2 Abstract release 1 pubblicata il 20 luglio :05 da Vittorio Sirolli RACCOLTA E PROCESSAMENTO CAMPIONI URINARI Estensori: Massimo Papale Francesco Trepiccione Revisore: Giovanni Candiano L urina è un liquido biologico potenzialmente ricco di informazioni sulla funzionalità renale, tuttavia la composizione dell urina viene costantemente influenzata dallo stato metabolico di ciascun individuo, dalle abitudini alimentari, dall assunzione di farmaci, dallo stile di vita e, in special modo per le donne, dai cicli ormonali. Occorre quindi considerare per ogni soggetto che verrà esaminato: età, sesso, abitudini alimentari, patologia e assunzione di farmaci. nonchè il reclutamento di un ampio numero di soggetti per ridurre l influenza dei fattori di confondimento non legati alla patologia oggetto di studio. Poiché la composizione quali/quantitativa delle urine varia in base al volume urinario, è indispensabile annotare, per ciascun paziente, il volume urinario nelle 24 ore. Inoltre, sul primo campione urinario del mattino, andranno eseguiti: esame urine + urinocoltura + dosaggio clinico (laboratorio centralizzato dell Ospedale) di proteinuria e creatininuria. raccolta e processamento dei campioni urinari release 1 pubblicata il 20 luglio :16 da Vittorio Sirolli RACCOLTA DEI CAMPIONI PER STUDI SU PROTEINE SOLUBILI Per ciascun paziente raccogliere ~200 ml di urine del mattino (seconda minzione) in contenitori da urinocoltura sterili Le urine possono essere conservate a4 Cper non più di 2 ore prima del processamento Centrifugare le urine a x g per10 a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti cellulari (conservare il pellet cellulare a -80 C, annotandone quantità, colore, consistenza) Trasferire il surnatante in tubi Falcon puliti facendo attenzione a non far rimescolare l eventuale pellet depositato sul fondo della provetta, dividendo le urine in 4 tubi Falcon da 50 ml Etichettare e conservare a -80 Ccome urine stock. Pag. 2 di 5

3 RACCOLTA DEI CAMPIONI PER ISOLAMENTO DEGLI ESOSOMI Usare contenitori sterili come da urinocoltura. Raccogliere un campione d urina dal secondo mitto della giornata e congelarlo subito a -80 C. La quantità richiesta per ogni soggetto dipende ovviamente dalla numerosità della popolazione in studio; principio guida deve essere che 1 lt di urina di individui adulti consente l isolamento di circa 100 ug di proteine esosomiali. Organizzare il trasferimento presso il laboratorio di analisi in ghiaccio secco. Appendice (1)DOSAGGIO PROTEICO CON IL METODO BRADFORD Il dosaggio Bradford è un metodo basato sul legame del colorante Blue Comassie G-250 alle proteine. A ph acido il colorante libero ha due picchi di assorbimento nel visibile, a 470 e a 650 nm; quando si lega ad una proteina ha un picco massimo di assorbimento a 595 nm. Vantaggi: Sensibilità del metodo fino a concentrazioni di 20 mg/ml; Semplicità di preparazione del reattivo; Sviluppo del colore immediato e stabilità del complesso. Svantaggi: Il metodo è relativo, perché la quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aa basici presenti; Difficile scelta di uno standard; Molte proteine sono insolubili in ambiente acido. Reagente cromogeno: Bio-Rad Protein Assay 450mL ( solution of Comassie Brilliant Blue G-250) Esecuzione del dosaggio: Pag. 3 di 5

4 Standard BSA(Bovine Serum Albumin) per retta di taratura: 0 ml, 12.5 ml, 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml della soluzione madre di BSA 0.2 mg/ml (corrispondenti rispettivamente a 0 mg, 2,5mg, 5 mg, 10 mg,15 mg, 20mg di proteina) portati ad un volume finale di 800 ml con H 2 O mq in 6 eppendorf distinte. Campioni urinari : 2 ml di campione portato ad un volume finale di 800 ml con H 2 O mq Bianco della reazione: 800 ml di H 2 O mq A ciascuna eppendorf (campioni, standard, bianco) si aggiungono 200 ml di reagent cromogeno. Ogni eppendorf viene vortexata e incubata a temperatura ambiente per almeno 5 minuti. L assorbanza viene letta allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 595 nm. Figure Viene costruita una retta di taratura della BSA ( asse delle ascisse concentrazioni in mg /ml degli standard, asse delle ordinate Assorbanza corrispondente) Pag. 4 di 5

5 Figura 1. Pag. 5 di 5

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