Scheda n.15. Vania Bresolin Cinetica enzimatica. Determinazione dell attività specifica di un enzima

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1 Scheda n.15 Vania Bresolin Cinetica enzimatica Determinazione dell attività specifica di un enzima ITAS Santorre di Santarosa Istituto Tecnico, settore Tecnologico Indirizzo Chimica, Materiali e Biotecnologie Opzioni: Biotecnologie Sanitarie Biotecnologie Ambientali Laboratori di Chimica corso Peschiera, Torino tel sito web santorre@santorre.it Progetto: Libro elettronico di laboratorio docenti: Vania Bresolin Patrizia Sgalambro Gianni Saglietto anno scolastico

2 Obiettivi e principi teorici Si valuta l influenza della concentrazione dell enzima invertasi sulla velocità della reazione enzimatica invertasi-saccarosio e si determina l attività specifica dell enzima a temperatura ambiente. Si ricorda che l invertasi catalizza la reazione di idrolisi del saccarosio in D-glucosio e in D- fruttosio. Saccarosio + H 2 O invertasi D-glucosio + D-fruttosio 1 mole 1 mole 1 mole Prendendo in considerazione la reazione dal punto di vista quantitativo si può osservare che l enzima invertasi catalizza l idrolisi di una mole di saccarosio in una mole di D-glucosio e in una mole di D-fruttosio, pertanto il numero di moli di prodotto è doppio rispetto al numero di moli di reagente. Si determinano le velocità di reazione enzima-substrato, ossia il numero di μmoli di saccarosio che spariscono e quindi di glucosio che si formano nell unità di tempo (in un minuto) a differenti concentrazioni dell enzima. (N.B. l attività è una velocità per unità di volume). Gli obiettivi di questa esperienza sono: Acquisire abilità manuale nell utilizzo di pipette e micropipette. Determinare la concentrazione di uno zucchero riducente utilizzando una retta di taratura standard di riferimento. Calcolare l attività specifica di un enzima utilizzando i dati ricavati dall esperienza. Allo scopo di realizzare gli obiettivi, si fanno reagire soluzioni a diversa concentrazione di enzima (invertasi) con una soluzione di substrato (saccarosio) in un tempo prefissato (10 minuti). Il substrato deve essere in grande eccesso rispetto alle capacità dell enzima di trasformarlo completamente in prodotto. A reazione avvenuta si determinano per via spettrofotometrica le concentrazioni delle soluzioni di glucosio + fruttosio formatisi utilizzando come agente ossidante 3,5-dinitrosalicilato di sodio (vedi scheda 13). Utilizzando la curva di taratura precedentemente costruita, dalle misure di assorbenza a 540 nm delle differenti soluzioni di 3-ammino, 5-nitrosalicilato di sodio (proiettando l assorbanza misurata sull asse delle x o calcolando x dall equazione della retta di taratura glucosio + fruttosio), si risale alle concentrazioni di glucosio + fruttosio (μmoli di glucosio e fruttosio in un ml di soluzione che si sono formate in 10 minuti). Si costruisce poi un grafico in cui si riporta sull asse delle ascisse la quantità espressa in μg di proteina nelle varie soluzioni e in ordinate le velocità di reazione espresse come μmoli di glucosio prodotto in un minuto. Quando in una reazione catalizzata da un enzima la concentrazione di substrato è in largo eccesso tutti i siti attivi dell enzima sono saturati e la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla quantità di enzima aggiunto. Sarebbe teoricamente possibile ottenere il valore dell attività specifica estrapolando la semiretta del grafico fino al valore di 1 mg di proteina sull asse delle ascisse, ma 2

3 praticamente ciò non è possibile data la lontananza del valore di 1 mg sull asse delle ascisse rispetto ai valori ottenuti nell esperienza. Pertanto si imposta una proporzione tra un valore individuato sul grafico (dalle coordinate x e y) ed il valore di 1 mg (1000 μg) oppure si ricava y dall equazione della retta. Si sottolinea che l attività e l attività specifica variano al variare della temperatura e che un aumento o una diminuzione della temperatura di 1 C determinano rispettivamente un aumento e una diminuzione dell attività del 10%. L attività specifica è una misura della purezza dell enzima: tanto più alto è il suo valore, tanto più l enzima è puro. 3

4 Attrezzatura e materiali Attrezzatura Spettrofotometro Vortex 2 Bunsen 2 Treppiede con reticella spargifiamma 2 Becher da 1 L con apposito portaprovette 4 posti Portaprovette 12 posti 6 Provette 16 x Tappi ad innesto per provette 16 x 160 Pinza di legno Provette 16 x160 e tappi ad innesto per provette Micropipetta da 0,1-1 ml con rispettivi puntali Micropipetta da 1-5 ml con rispettivi puntali Cronometro Pipetta graduata da 10 ml Palla di Peleo Cuvette monouso Materiali Soluzione 0,01 M di glucosio + fruttosio Soluzione 0,5 M di saccarosio Soluzione tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 Soluzione di invertasi 2,5 µg/ml (0,825 U.I./mL) Soluzione 1% 3,5-dinitrosalicilato di sodio Acqua distillata 4

5 Procedimento L esperienza viene condotta in coppia. Un allievo introduce i reagenti nelle prime tre provette, il secondo nelle altre tre. Mettere l acqua nei 2 becher da litro con l apposito portaprovette a 4 posti e scaldare fino ad ebollizione. Intanto disporre 6 provette nel portaprovette a 12 posti e numerarle da 1 a 6 con il pennarello vetrografico. Disporre i reagenti nel seguente ordine: tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 invertasi 2,5 µg/ml (0,825 U.I./mL) acqua saccarosio 0,5 M 3,5-dinitrosalicilato di sodio 1 %. Introdurre nelle 6 provette (p1-p6) i reagenti nei volumi qui di seguito riportati. Quando sarà necessario verrà anche indicata l operazione da compiere ad un certo momento della sequenza. Reagenti Volumi [ml] nelle provette p1 p2 p3 p4 p5 p6 tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 invertasi 2,5 µg/ml (0,825 U.I./mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 acqua 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 L aggiunta del substrato (saccarosio) darà inizio alla reazione. Dopo aver aggiunto 0,5 ml della soluzione di saccarosio nella provetta 1 si fa partire il cronometro e si attendono intervalli di tempo di 1 minuto prima di mettere il substrato via via nelle varie provette. saccarosio 0,5 M 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Trascorsi 10 minuti dall aggiunta di saccarosio, quindi nelle varie provette rispettivamente dopo 10, 11, 12, 13, 14, 15 minuti si aggiunge il 3,5-dinitrosalicilato di sodio 1%. Tale aggiunta denatura l enzima, quindi la reazione da esso catalizzata si blocca. 3,5-dinitrosalicilato di sodio 1 % Immergere le provette in acqua bollente (inizio reazione) per 5 minuti esatti. (La reazione tra glucosio / fruttosio e il 3,5-dinitrosalicilato di sodio avviene solo in queste condizioni). acqua 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Chiudere le provette con i tappi ad innesto. Agitare le provette nel vortex per uniformare le soluzioni e raffreddare a temperatura ambiente. Azzerare lo spettrofotometro con il bianco (soluzione nella provetta 1) alla lunghezza d onda di 540 nm. 5

6 Leggere allo spettrofotometro le assorbanze delle soluzioni contenute nelle altre provette a 540 nm e annotare le misure nella sezione dati e calcoli. Calcolare le velocità delle reazioni enzima-substrato e annotare i risultati secondo quanto indicato nella sezione dati e calcoli. Costruire il grafico secondo quanto indicato nella sezione dati e calcoli e determinare l attività specifica. 6

7 Dati e calcoli Dati V FINALE reazione: 12 ml Tempo di reazione: 10 min Concentrazione soluzione di invertasi: 2,5 µg/ml Coefficiente angolare m della retta di taratura: Volume soluzione di invertasi aggiunto nelle provette (p1-p6) [ml] N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 V slz INVERTASI [ml] 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Trascrivere i valori delle assorbanze misurate allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 540 nm. Dati registrati: Assorbanze misurate a 540 nm (A 540nm ) N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 A 540 nm 0,000 Calcoli Primo parametro da determinare è la massa di proteina in µg presente nelle 6 provette. Impostazione dei calcoli massa PROTEINA [µg] C slz INVERTASI [µg/ml] x V INVERTASI aggiunto [ml] Le masse di proteina nelle 6 provette sono le seguenti: Masse (m) di proteina [µg/ml] N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 m proteina [µg/ml] 0,0 Secondo parametro da determinare è la concentrazione di glucosio + fruttosio presente nelle 6 provette dopo la reazione dell invertasi con il saccarosio. La concentrazione di glucosio + fruttosio si determina dalla retta di taratura costruita nel corso dell esperienza precedente proiettando l assorbanza misurata sull asse delle x o calcolando x dall equazione della retta di taratura y = mx. 7

8 Le concentrazioni incognite di glucosio + fruttosio si trovano facendo il rapporto tra le assorbanze misurate e il coefficiente angolare della retta di taratura glucosio + fruttosio: Impostazione dei calcoli C GLU+FRU [µmol/ml] A 540nm / m retta di taratura Le concentrazioni di glucosio e fruttosio nelle 6 provette sono le seguenti: Concentrazioni di glucosio + fruttosio (C GLU+FRU ) [µmol/ml] N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 [µmol/ml] 0,00 Resta da determinare la velocità v o delle reazioni enzima-substrato nelle 5 provette (Nel bianco l enzima non viene messo). Tenuto conto che la velocità di una reazione enzima substrato viene espressa in µmoli di substrato che si trasformano nell unità di tempo e che in questo caso il numero di µmoli di prodotto è doppio rispetto al numero di µmoli di substrato, occorre dividere per due la concentrazione di glucosio + fruttosio, dividere per il tempo di reazione (10 minuti) e moltiplicare per il volume di reazione (12 ml): Impostazione dei calcoli v o [µmol GLU /min] C slz GLU+FRU [µmol/ml] x V FINALE reazione [ml] 2 x tempo di reazione [min] Le velocità delle reazioni enzima-substrato nelle 6 provette sono le seguenti: Velocità v o delle reazioni invertasi-saccarosio [µmol GLU /min] N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 v o [µmol GLU /min] 0,0000 8

9 Si annotano ora in una tabella i valori delle masse m di proteina calcolate espressi in µg che verranno poi riportati in ascisse (asse x) e i valori calcolati delle velocità v o in µmol/min, che verranno poi riportati in ordinate (asse y). massa PROTEINA [µg]) v o [µmol GLU /min] 0,0 0,0000 Costruire il grafico utilizzando un apposito programma (Excel oppure Open Office). Riportati i valori sull asse delle x e delle y, si individuano 6 punti di coordinate x;y. Tracciare una retta che interpoli i punti segnati sul grafico che parta dall origine degli assi, ossia dal punto (0;0), escludendo, se necessario, valori anomali. Nota La retta deve passare per l origine, ossia per il punto 0;0. Ricordarsi pertanto di impostare intercetta = 0;0. La retta deve avere equazione y 1 = m 1 x 1, poiché q 1 = 0. Costruito il grafico, annotare nella tabella seguente i parametri della retta: Parametri della retta m 1 q 1 0 Equazione della retta: Resta da quantificare l attività specifica. Si ricorda che l attività specifica viene espressa come numero di unità internazionali di enzima presenti in un milligrammo di proteina, quindi come numero di moli di substrato trasformato o di prodotto formato da un mg di proteina in 1 minuto, ad un certo valore di ph e ad una certa temperatura. In questo caso viene espressa come numero di moli di glucosio formato da 1 mg di proteina in un minuto. Ponendo quindi x 1 = 1 mg = 1000 µg, y 1 sarà l attività specifica. 9

10 Impostazione calcolo dell attività specifica 1 Attività specifica a C m 1 [µmol] [min x mg] x 1000 µg/mg Attività specifica a C = µmol min x mg 1 Arrotondare il risultato ad un valore intero. 10

11 Approfondimento Si riportano qui di seguito i dati misurati e i risultati ottenuti nel corso dell anno scolastico dagli alunni della classe quinta sezione L. Dati registrati Alunni Assorbanze misurate a 540 nm (A 540nm ) nelle provette p1 p2 p3 p4 p5 p6 Torrisi - Monchiero 0,000 0,313 0,713 1,193 1,471 1,887 Vecchia - Valpreda 0,000 0,361 0,739 1,030 1,336 Prov. rotta Girolimetto - Vaschetto 0,000 0,518 0,826 1,137 1,261 2,228 Simonis - Falzarano 0,000 0,270 0,504 0,528 1,179 1,545 Valdez 0,000 0,357 0,783 1,239 1,571 1,679 Assorbanze medie nelle sei provette (p1-p6) N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 A 540nm media 0,000 0,364 0,713 1,025 1,364 1,835 Coefficiente angolare m della retta di taratura 0,70 11

12 Riportando sull asse delle ascisse (asse x) i valori delle masse di proteina espresse in µg e sull asse delle ordinate (asse y) i valori delle velocità v o, si ottiene il seguente grafico: Parametri della retta m 1 q 1 Equazione della retta: y 1 = 0,6448 x 1 0, Attività specifica a 22 C = 645 µmol min x mg 12

13 Bibliografia Biochimica di base in laboratorio Giuliano Ricciotti Italo Bovolenta Editore, ISBN Enzyme kinetics of invertase via initial rate determination Nam Sun Wang 13