RISOLUZIONE OIV/ENO 340/2010. DETERMINAZIONE DELL ATTIVITA β-glucanasi (β 1-3, β 1-6) DELLE PREPARAZIONI ENZIMATICHE

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1 RISOLUZIONE OIV/ENO 340/2010 DETERMINAZIONE DELL ATTIVITA β-glucanasi (β 1-3, β 1-6) DELLE PREPARAZIONI ENZIMATICHE L'ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell Organizzazione Internazionale della Vite e del Vino Avendo preso atto dei lavori del gruppo di esperti Specificazione dei prodotti enologici DECIDE, sotto proposta della Commissione II «Enologia», di integrare il Capitolo II del Codice Enologico Internazionale con le seguenti tecniche analitiche e di controllo: DETERMINAZIONE DELL ATTIVITA β-glucanasi (β 1-3, β 1-6) DELLE PREPARAZIONI ENZIMATICHE 1. CAMPO D APPLICAZIONE Materie prime e preparazioni commerciali che contengono enzimi con attività β-glucanasi. 2. PRINCIPIO Il metodo di analisi è basato sul dosaggio del glucosio liberato tramite l enzima, di cui si vuole misurare l attività, a partire da una soluzione standardizzata di glucano di Schizophyllum sp. 2.1 Definizione delle unità L unità di β-glucanasi (β-glu-u) è definita come la quantità di zuccheri riduttori, espressa in glucosio, che è liberata nelle condizioni sperimentali da 1 g (o 1 ml) di enzima al minuto. 2.2 Ruolo dell enzima Botrytis cinerea secerne, durante la sua crescita sulle uve infettate (marciume grigio o nobile), un β-1,3-glucano che possiede ad ogni terza unità di glucosio un residuo glicosilato di glucosio in β-1,6 (Fig.1). Tale glucano é molto simile a quello sintetizzato da Schizophyllum sp. 1

2 ß-1,6-Glicoside ß-1,3-Glicoside 2.3 Principio di misurazione L attività enzimatica libera glucosio che, in soluzione basica, riduce l acido 3,5-dinitrosalicilico in acido 3-ammino-5-nitrosalicilico. Un aggiunta di fenolo aumenta la sensibilità della reazione. L idrogenosolfito di sodio serve a stabilizzare la colorazione. 3. ATTREZZATURA 3.1 Spettrofotometro e cuvette da 1 cm di percorso ottico 3.2 Bagno d acqua 40 C, 100 C 3.3 Agitatore magnetico standard 3.4 Agitatore magnetico multipunto che può essere sommerso, regolato a 300 rpm 3.5 Flaconi da misurazione (palloni graduati, cilindri, beute ) 3.6 Becker 3.7 Micropipette 3.8 Cronometro 3.9 Bagno a ultrasuoni 3.10 ph-metro 2

3 4. REAGENTI E PRODOTTI 4.1 Substrato Soluzione madre di glucano fornita dall università di Braunschweig 1 il cui tenore in glucano è stato determinato dall università di Braunschweig. 4.2 Prodotti puri Acido citrico monoidrato (CAS N ) Idrossido di sodio (CAS N ) Tartrato di sodio e di potassio (CAS N ) Metabisolfito di sodio Na 2 O 5 S 2 (CAS N ) Fenolo(CAS N ) Glucosio anidro Acido 3,5-dinitro-2-idrossibenzoico (3,5-dinitrosalicilico) (CAS N ) Acqua distillata 4.3 Soluzioni Soluzione di idrossido di sodio 1M In un pallone graduato da 100 ml sciogliere 4,0 g di idrossido di sodio (4.2.2) e portare a volume con acqua distillata (4.2.8) Soluzione tampone citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l In un pallone graduato da 500 ml, vengono sciolti 21,0 g d'acido citrico monoidrato (4.2.1) in 400 ml d acqua distillata (4.2.8), poi il ph è regolato a 4,0 con una soluzione molare d idrossido di sodio (4.3.1) e si porta a volume con acqua distillata (4.2.8) Soluzione tampone citrato (ph 4,0), 0,1 mol/l In un pallone graduato da 1000 ml, vengono sciolti 21,0 g d acido citrico monoidrato (4.2.1) in 900 ml d acqua distillata (4.2.8), poi il ph è regolato a 4,0 con una soluzione molare d idrossido di sodio (4.3.1) e si riempie con acqua distillata (4.2.8) Soluzione di titolazione: reagente colorimetrico acido DNS-(dinitrosalicilico) in soluzione fenolica. E preparato partendo dalle soluzioni A, B, C sottoindicate : Soluzione A: Pesare 154,2 g de tartrato di sodio e di potassio (4.2.3) in un beckerda 800 ml e sciogliere completamente in 500 ml di acqua distillata (4.2.8). Aggiungere 9,7 g d idrossido di sodio (4.2.2) Soluzione B: In un cilindroda 2000 ml sciogliere completamente 5,3 g di acido di 3,5-dinitrosalicilico (4.2.7) in 500 ml d acqua distillata (4.2.8). I migliori risultati sono ottenuti utilizzando il bagno ad ultrasuoni Soluzione C: In un cilindro da 100 ml sciogliere 4,2 g di fenolo (4..2.5) in 50 ml d acqua distillata (4.2.8). Aggiungere quindi 1g d idrossido di sodio (4.2.2) e, dopo il completo scioglimento, 4,2 g di bisolfito di sodio (4.2.4) e sciogliere nuovamente Soluzione di glucosio a 0,3 % In un pallone graduato da 100 ml mettere esattamente 300 mg di glucosio (4.2.6), sciogliere nell acqua distillata (4.2.8) e poi portare a volume con acqua distillata. 1 Prof. Dr. Udo Rau, Technical University Braunschweig, Department of Biochemistry and Biotechnology Spielmannstr. 7, Braunschweig - Germany 3

4 Reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica Le soluzioni A e C sono mescolate con la soluzione B in un becker da 2000 ml che è in seguito coperto con carta d alluminio. Prima dell uso, conservare al buio per almeno tre giorni. Travasare il reagente in una bottiglia di vetro scuro. Immagazzinare in un luogo scuro e a una temperatura di C ; la soluzione può essere utilizzata entro un mese. Per ogni reagente preparato da poco tempo e prima di ogni analisi, è effettuata una calibratura prima di ogni analisi dell enzima. Prima di ogni utilizzo, devono essere aggiunti 3 ml di una soluzione di glucosio a 0,3% ( ), a 200 ml del reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica Glucano in soluzione a 0,1%, ph 4,0 Pesare la quantità esatta di soluzione madre di glucano (4.1), per ottenere una concentrazione finale di 1g/l. La soluzione finale di substrato deve contenere 50% della soluzione tampone di citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (4.3.2) Per ottenere 100 ml della soluzione di substrato a partire dalla soluzione madre di glucano (4.1) (contenente realmente 5.2 g/l), sono pesati 19,2 g in un beckerda 100 ml. Vengono aggiunti 50 ml della soluzione tampone di citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (4.3.2). Realizzare una soluzione omogenea di glucano rimescolando per almeno 15 minuti. La soluzione ben omogeneizzata è aggiustata a ph 4,0 con una soluzione molare di idrossido di sodio (4.3.1). La soluzione è trasferita in un pallone graduato da 100 ml e portato a volume con acqua distillata (4.2.8) Ogni soluzione madre di glucano è conservata a temperatura ambiente. Se viene utilizzata una nuova soluzione madre di glucano, si deve determinare un fattore di substrato di glucano (Gf = fattore di glucano) tramite l enzima standard. Il fattore Gf del glucano è indispensabile per confrontare i risultati delle soluzioni madri precedenti di glucano con le nuove. Il fattore Gf di glucano è calcolato con i valori misurati considerando che l attività enzimatica standard è di β-glu U/g o ml nella formula (vedi: Calcolo dell attività enzimatica). 4.4 Preparazioni enzimatiche Soluzione Standard di enzimi Glucanasi: 0,5 g di preparazione enzimatica Standard di Glucanasi è sciolta in 25 ml della soluzione tampone di citrato (ph 4,0 ; 0,1 mol/l) (4.3.3) e portata a volume fino a 100 ml con acqua distillata (4.2.8) Per tutte le altre preparazioni enzimatiche: Sono sciolti 1 ml di preparazione enzimatica o 0,5 g di preparazione enzimatica solida in polvere o in granulato in 25 ml di soluzione tampone di citrato (ph 4,0 ; 0,1 mol/l) (4.3.3) e portata a volume fino a 100 ml con acqua distillata (4.2.8). Se i valori d assorbimento sono troppo alti o troppo bassi (intervallo di assorbanza ), è necessaria una diluizione appropriata. La diluizione di enzimi deve contenere il 25% della soluzione tampone citrato (4.3.3). 5. MODO OPERATIVO 5.1 Prova in bianco del reagente Aggiungere 7 ml di reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica (4.3.4) a 3 ml di acqua distillata (4.2.8) in un pallone graduato da 50 ml e riscaldarlo per 10 minuti esatti su un bagno d acqua bollente. 4

5 Raffreddare quindi per 5 minuti di un bagno d acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagno d acqua a 20 C e aggiungere acqua distillata (4.2.8) senza raggiungere il segno graduato. Dopo 10 minuti a 20 C riempire fino al segno di graduazione 5.2 Curva di calibrazione del glucosio con reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica. Sciogliere 2,00 g di glucosio (4.2.6) in un pallone graduato da 200 ml e portare a volume con acqua distillata (4.2.8). Partendo da questa soluzione, preparare le diluizioni come segue: N V soluzione / 100 glucosio (µg) nella prova glucosio/100 ml ml (= 0,5 ml) 1 2 ml 20 mg 100 µg 2 5 ml 50 mg 250 µg 3 10 ml 100 mg 500 µg 4 15 ml 150 mg 750 µg 5 20 ml 200 mg 1,000 µg 6 30 ml 300 mg 1,500 µg 7 40 ml 400 mg 2,000 µg Introdurre con l aiuto della pipetta 0,5 ml di ogni diluizione di glucosio in un pallone graduato da 50 ml e aggiungere 7 ml di reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica (4.3.4) e 2,5 ml d acqua distillata (4.2.8). Riscaldare i recipienti per 10 minuti esatti in un bagno d acqua bollente. Raffreddare quindi per 5 minuti in un bagno d acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagno d acqua a 20 C e aggiungere acqua distillata (4.2.8) senza portare a volume. Dopo 10 minuti a 20 C portare a volume. Misurare l assorbanza delle soluzioni mediante spettrofotometro nei 15 minuti seguenti, alla lunghezza d onda di 515 nm contro il bianco (solo reagente). Segnare in un diagramma la quantità di glucosio liberata nella prova contro l assorbanza a 515 nm (Fig. 2). La curva di campionatura è eseguita lo stesso giorno prima di ogni analisi dell enzima. 5

6 Calibrazione mediante reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica glucosio Figura Prova in bianco degli enzimi Introdurre con l aiuto della pipetta 0,5 ml di ogni soluzione di enzimi (4.4.1 o 4.4.2) in un pallone graduato da 50 ml e aggiungere 7 ml di reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica (4.3.4). Mescolare accuratamente e aggiungere 2,5 ml della soluzione di substrato (4.3.5). Mescolare bene agitando manualmente. In seguito riscaldare tutti i campioni in un bagno d acqua bollente per esattamente 10 minuti. Raffreddare in seguito per 5 minuti in un bagno d acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagno d acqua a 20 C e aggiungere acqua distillata (4.2.8) senza portare a volume. Dopo 10 minuti a 20 C portare a volume. Misurare l assorbanza delle soluzioni tramite spettrofotometro nei 15 minuti successivi, alla lunghezza d onda di 515 nm contro il bianco (solo reagente). 5.4 Misurazione dell attività di preparazioni enzimatiche Per ogni campione di enzimi, vengono messi 10 ml di substrato (4.3.5) in una beuta per 5 minuti in un bagno d acqua a 40 C. I campioni devono essere omogeneizzati con l aiuto di un agitatore magnetico multipunto ad immersione regolato a 300 rpm. Dopo 5 minuti, vengono aggiunti 2 ml della soluzione di enzimi (4.4.1 o 4.4.2) nel primo campione e si fa partire un cronometro subito dopo l aggiunta della prima soluzione di enzimi. Aggiungere quindi le soluzioni di enzimi seguenti a tutti gli altri campioni con un intervallo di 30 secondi per ogni campione. I campioni devono essere agitati in seguito a 300 rpm per tutto il tempo di reazione. Dopo esattamente 15 minuti prelevare 3 ml della prima miscela, seguita da tutti gli altri campioni con un intervallo di 30 secondi. Ogni miscela da 3 ml è introdotta con l aiuto di una pipetta in un numero corrispondente di palloni graduati da 50 ml, contenente ciascuno 7ml di reagente colorimetrico DNS in soluzione fenolica (4.3.4). In seguito riscaldare tutti i campioni in un bagno d acqua bollente per 10 minuti esatti rispettando l intervallo di 30 secondi tra i campioni. 6

7 Raffreddare quindi per 5 minuti in un bagno d acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagno d acqua a 20 C e aggiungere acqua distillata (4.2.8) senza portare a volume. Dopo 10 minuti a 20 C riempire. Misurare l assorbimento delle soluzioni tramite lo spettrofotometro nei 15 minuti seguenti, con la lunghezza d onda di 515 nm contro il bianco (solo reagente). La differenza di assorbimento tra la lettura del bianco degli enzimi ed il valore dopo la reazione deve essere compresa tra 0,1 e 0,6 unità di assorbimento. Se i valori sono al di là d'intervallo di misura della curva di calibrazione, ripetere la prova con diluizioni adattate degli enzimi. Con tutti gli enzimi, preparare sempre 1 lettura del bianco degli enzimi e 2 valori dopo la reazione. I due valori dopo la reazione devono essere vicini. 6. Calcoli Per il calcolo dell attività utilizzare il valore medio delle due misure. L attività enzimatica di una preparazione enzimatica è calcolata secondo la formula seguente : Attività β-glu-unità/g o ml = (G X 200)/(15 x E) X 1/Gf Nkat/g o ml = (Attivitá β-glu-unità/g o ml) X (1000/60) G = quantità di zuccheri riduttori liberati nella prova (zuccheri riduttori liberati tramite Δ = media di 2 ripetizioni dell assorbanza dopo reazione l assorbanza del bianco degli enzimi, calcolato in glucosio a partire dalla curva di calibratura del glucosio in µg). E = quantità di enzima diluito a 100 ml in g o ml 200 = fattore di diluizione 15 = tempo di reazione Gf = fattore di glucano (da calcolare) Esempio di calcolo: Enzima Enzima Standard Penicillium funiculosum ß-Glucanasi Valore misurato 1 2 Bianco degli enzimi E µg glucosio Unità ß- Glu/go ml 0,621 0,618 0,415 0, ,417 0,416 0, Calcolo del Gf: 1 effettuare la misura con substrato utilizzato in precedenza e l enzima standard (Valore 1) 2 effettuare la misura con il nuovo substrato e l enzima standard (Valore 2) Calculo : valore 1 / valore 2 7. Bibliografia Bertrand A. Determination de l'activite β-glucanase de Botrytis des preparations enzymatiques OIV FV