19a.5.1 Flaconcini in vetro, tipo Vial, con tappo in gomma rivestito in politetrafluoroetilene da ml.
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- Costanza Ceccarelli
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1 Giugno a. Fenoli 19a.l Principio del metodo II metodo si basa sull'analisi tramite cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) di un estratto organico, ottenuto da un campione di fango o di rifiuto solido, utilizzando un rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, selettivo per i composti aromatici. Può essere anche impiegato un rivelatore UV a lunghezza d'onda fissa a 220 mm. Con tale rivelatore però diminuisce la sensibilità per i composti a tempo di ritenzione più lungo. 19a.2 Campo di applicazione La risposta del detector dipende dal numero e dal tipo dei sostituenti presenti nel fenolo. Per i 17 composti considerati si possono determinare concentrazioni non inferiori a 100 µg/kg di campione. 19a. 3 Interferenze Composti organici aromatici, con tempi di ritenzione coincidenti con quelli dei composti in esame, danno interferenze se presenti nel campione. In questo caso occorre procedere ad una purificazione acido-base dell'estratto organico, come indicato m Appendice 3. 19a.4 Campionamento e conservazione del campione II prelievo e la conservazione del campione devono essere effettuati in accordo con quanto previsto dai Metodi di campionamento dei fanghi e rifiuti solidi. Quaderni IRSA 64, Appendice 1. Poiché alcuni fenoli sono facilmente degradabili i campioni vanno conservati al buio e in frigorifero. Qualora il campione risulti umido, deve essere disidratato con una quantità di solfato sodico sufficiente a favorire l'estrazione con il solvente. 19a.5 Apparecchiatura Normale attrezzatura da laboratorio. 19a.5.1 Flaconcini in vetro, tipo Vial, con tappo in gomma rivestito in politetrafluoroetilene da ml. 19a.5.2 Microsiringhe per liquidi. 19a.5.3 Cromatografìa liquida ad alte prestazioni (HPLC) dotata di rivelatore UV ( nm), due pompe e sistema di integrazione e calcolo. 19a.5.4 Colonna cromatografica di lunghezza 250 mm, diametro interno 4.6 mm, riempimento tipo spherisorb S5 OD S2 con granulometria 5µm. 19a.5.5 Iniettore calibrato da 20 µ1. 19a.5.6 Bagno ad ultrasuoni termostatato. 19a.5.7 Evaporatore rotante.
2 19a.6 Reattivi Tutti i composti usati per la preparazione delle soluzioni di taratura devono essere reagenti di ottima qualità di purezza superiore al 99.5%. Inoltre occorre utilizzare acqua bidistillata o tipo I (Standard Methods). 19a.6.1 Acetonitrile per HPLC. 19a.6.2 Cloroformio per pesticidi. 19a.6.3 Alcol metilico per pesticidi. 19a.6.4 Sodio solfato anidro per estrazione purificato con CH 2 Cl 2. 19a.6.5 Acido acetico glaciale. 19a.6.6 Soluzione di NaOH 3M. 19a.6.7 Soluzione di H 2 SO 4 5M. 19a.6.8 Fenoli per la calibrazione del metodo: Fenolo, orto-cresolo, meta- Cresolo, 4-nitro-Fenolo, 2-cloro-Fenolo. 2,4-dinitro" fenolo, p-cloro-fenolo, m-cloro-fenolo, 2-nitro-Fenolo, 2,4-dimetil-Fenolo, o-etil-fenolo, 4-cloro, 3 metil-fenolo, 2, 4-dicloro-Fenolo, 2.4,6-trimetil-Fenolo, 2,4,6-tricloro-Fenolo, 2, 3, 4, 5-tetracloro-Fenolo, penta-cloro-fenolo. Verifìcare che ogni composto presenti un solo picco cromatografico nelle condizioni di lavoro previste per la taratura. 19a.7 Preparazione della soluzione di taratura In considerazione della composizione molto variabile dei campioni daanalizzare è opportuno preparare soluzioni di taratura di singoli composti e non di miscele. 19a.7.1 Soluzioni contenenti 1000 mg/l In matracci tarati da 100 ml pesare 100,0 mg di ciascun composto (19a.6.8) e portare a volume con acetonitrile. La soluzione se conservata in congelatore ( 20 C) è stabile per almeno due mesi. 19a.7.2 Soluzione contenente 50 µg/ml di ogni soluzione madre (19a.7.1). In un matraccio da 100 ml si introducono 5 ml di ogni soluzione madre e si porta a volume con acetonitrile. 19a.7.3 Soluzione contenente 10 µg/ml. In un matraccio da 50 ml si introducono 10 ml della soluzione 19a.7.2 e si porta a volume con acetonitrile. 19a.7.4 Soluzione contenente 1 µg/ml. In un matraccio da 50 ml si introduce 1 ml della soluzione 19a.7.2 e si porta a volume con acetonitrile.
3 19a.8 Procedimento 19a.8.1 Estrazione del campione In un flaconcino (19a.5.1) si pesa una quantità P (ca. 1 g) di fango, vi si addizionano 0.5 ml di acido acetico (19a.6.5), vi si introduce una aliquota di sodio solfato (19a.6.4) sufficiente a disidratare il fango, quindi si aggiungono 5 ml di acetonitrile. Si tappa il flacone e si estrae per 30 minuti in bagno a ultrasuoni (19a.5.6) la cui temperatura non deve superare i 30 C. L'estrazione va ripetuta altre due volte. Si lascia depositare fino a completa separazione della fase liquida e si decanta. 19a.8.2 Determinazione cromatografica L'estratto può venire utilizzato previa diluizione 1:1 con la fase mobile di partenza. In caso di campioni contenenti basse con-centrazioni di analiti, è possibile concentrare l'estratto (Vf) (ca. 15 mi) fino a 1 mi (Vt) sotto leggero flusso di azoto, e poi diluirlo 1;1 nella fase mobile. Si iniettano 20 µl, nello strumento (19a.5.3) già predisposto per l'analisi e viene misurata l'area dei picchi. L'identificazione dei Fenoli presenti nel campione viene eseguita in base al confronto dei tempi di ritenzione dei picchi incogniti con quelli degli standards di riferimento. L'analisi quantitativa si effettua con il metodo dello standard esterno mediante curva di taratura, una per ogni singolo composto, preparando le soluzioni standard e registrando le aree dei picchi. 19a.9 Calcolo La concentrazione C, di ogni componente presente nel campione espressa in mg/kg, è data dalla relazione: C i = A. Vt. F. 2 P. V i Dove: A = quantità del composto calcolato dalla curva di calibrazione (µg) P = peso del campione estratto (g) Vj = volume del campione iniettato (µl) Vt = volume del solvente di estrazione (µl) F = fattore di concentrazione V t /V f
4 Appendice 1 Condizioni strumentali indicative Fase mobile A: acqua tipo I (Standard Methods) con 1% acido acetico Fase mobile B: acetonitrile Gradiente: O min. = A 68% B 32% 15 min. = A 64% B 36% 30 min. = A 46% B 54% 40 min. = A 385 B 62% Portata = 1.2 ml/min. Rivelatore: 0-25 min. 280 nm min. 290 nm min. 300 nm
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6 Appendice 2 Esempio di cromatogramma dei fenoli ottenuto con le sopraindicate condizioni strumentali. COMPOSTO TR FENOLO NITRO-F 6.85 m-cresolo 7.79 o-cresolo 8.59 o-cloro-f ,4-DINITRO p-cloro-f m-cloro-f NITRO-F ,4-DIMETIL o-etil-f C1-3-METIL ,4-DICLORO ,4,6-TRIMET ,4,6-TRICL ,3,4,5-TETROL PENTACLORO TOTALE
7 Appendice 3 Purificazione del campione Si pongono in imbuto separatore con rubinetto in politetrafluoro-etilene 5 ml dell'estratto dei 15 iniziali (19a.8.1) in acetonitrile, si aggiungono 20 ml di cloroformio (19a.6.2) e 20 ml di NaOH (19a.6.6). Si agita per 5 min e si elimina la fase organica. La fase acquosa viene lentamente acidificata con H 2 SCO 4 (19a.6.7) fino a ph 2, facendo attenzione a non surriscaldare il campione, ed estratta con tré aliquote da 15 ml di cloroformio (19a.6.2). L'estratto organico viene addizionando con 2 ml di metanolo (19a.6.3) e concentrato a 1 ml in evaporatore rotante (19a.5.7). Si diluisce nella fase mobile 1:1. Per il calcolo è necessario moltipllcare C i per 3. Per i seguenti composti elencati la resa di purificazione è compresa tra U 65% ed il 70%: Fenolo, Cresoli, 2,Nitro-Fenolo, o-cloro-fenolo, 2,4,6-TKmetil-Fenolo. Nel caso di analisi quantitative, è indispensabile valutare con delle prove la resa della procedura di purificazione.
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