Progetto CROSS: Carry-over: stato dell arte Mangimifici Italia Marilena Gili Roma, 30 ottobre 2015

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1 Progetto CROSS: Carry-over: stato dell arte Mangimifici Italia Marilena Gili Roma, 30 ottobre 2015

2 MIN. SAL. TETRACICLINE SULFAMIDICI Il progetto ASSALZOO C.Re.A.A.

3 La catalogazione dei campioni Ogni campione è stato conferito al laboratorio in imballo individuale catalogato come Prova 1, Prova 2. Prova 25

4 La catalogazione dei campioni Ogni scatola conteneva all interno vari sacchetti, ciascuno etichettato con una lettera: T A B C D P E sempre presente l aliquota T, sinonimo di TRACCIANTE, su cui il laboratorio verifica la conformità al dichiarato in p.a. Non sempre sono presenti tutte le lettere da A a D: su queste il laboratorio ricerca il p.a. a livello di carry-over. E sempre presente l aliquota P, sinonimo di post-pellettatura, su cui il laboratorio ricerca il p.a. a livello di carry-over.

5 La catalogazione dei campioni I campioni sono pervenuti già macinati. Per ogni lettera sono sempre presenti due sacchetti, corrispondenti a punti diversi di prelievo: es. T1 T2 A1 A2 Ogni sacchetto rappresenta il campione di laboratorio ed è stato analizzato in due repliche indipendenti.

6 L approccio analitico Livello Titolo Metodo analitico per la verifica della conformità al dichiarato nei mangimi medicati mg/kg Livello carry over Metodo analitico per la verifica di presenza di p.a. a livello di carry-over in mangimi bianchi mg/kg

7 L approccio analitico Problemi connessi: i livelli di concentrazione di analita tra dose di utilizzo e carry-over differiscono di circa 2 ordini di grandezza in generale sono necessari 2 diversi metodi di analisi; poiché non sono disponibili metodi ufficiali, il laboratorio deve sviluppare e validare in house 2 diversi metodi di prova; è necessaria una fase di purificazione e concentrazione del campione prima dell analisi.

8 PESATA Preparazione campione: ESTRAZIONE CENTRIFUGAZIONE CARRY-OVER SGRASSSATURA PURIFICAZIONE SPE CONCENTRAZIONE DOSE UTILIZZO diluizione DERIVATIZZAZIONE ANALISI STRUMENTALE

9 L effetto della matrice: In generale i metodi chimici risentono molto dell effetto della matrice. Nel caso dei mangimi, questo effetto è accentuato dalla eterogeneità di composizione a seconda della tipologia e della specie di destinazione: diventa ancor più rilevante per le ricerche a livelli di carryover, che richiedono una pre-concentrazione degli estratti del campione.

10 L effetto della matrice: Può dare risultati variabili, per cui deve esser studiato a fondo durante lo sviluppo del metodo MANGIMI SEMPLICI BOVINI - SUINI COMPLETI OVICAPRINI - PESCI COMPLEMENTARI CONIGLI - VOLATILI

11 L approccio analitico SULFAMIDICI 1. Verifica del titolo in p.a. Pesata: 10 o 20 g, in base al tenore di p.a. dichiarato Estrazione: 100 ml NaOH 0.05 M in acqua/meoh (1/1) 1 h in agitatore a inversione + 30 min in ultrasuoni Centrifugazione e diluizione con fase mobile HPLC FD da 1/10 a 1/50 in base al tenore di p.a. dichiarato metodo di analisi multiresiduo HPLC-DAD; campo di misura mg/kg. Incertezza di misura del risultato: U = 10%

12 L approccio analitico SULFAMIDICI 2. Verifica del carry-over Pesata: 4 g di campione macinato Estrazione: 2 x 20 ml etile acetato (anidrificante Na 2 SO 4 ) Centrifugazione e evaporazione Ripresa con HCl 0.1M acquoso e sgrassatura con esano Purificazione SPE Scambio Cationico Evaporazione e ripresa con fase mobile HPLC metodo di analisi multiresiduo HPLC-DAD campo di misura 1 10 mg/kg. POS 10CH126

13 L approccio analitico SULFAMIDICI 2. Verifica del carry-over Analisi quantitativa: interpolazione su retta di taratura in solvente. Effetto matrice: corretto mediante utilizzo di standard interno per la determinazione quantitativa (area relativa). Recupero: correzione per il fattore di recupero di seduta (spiked). Incertezza di misura estesa del risultato: U = 20% (k=2, p=95%) POS 10CH126

14 L approccio analitico TETRACICLINE 1. Verifica del titolo in p.a. Pesata: 4-8 g, in base al tenore di p.a. dichiarato Estrazione: 40 ml HCl 0.2 M in metanolo 1 h in agitatore a inversione + 30 min in ultrasuoni Centrifugazione e diluizione 1/5 con fase mobile HPLC metodo di analisi multiresiduo HPLC-DAD; campo di misura mg/kg. Incertezza di misura estesa del risultato: U = 12% (k=2, p=95%) POS 10CH087

15 L approccio analitico TETRACICLINE 2. Verifica del carry-over Pesata: 4 g di campione macinato Estrazione: 2 x 10 ml acido succinico 0.1M acquoso Centrifugazione + 2 x 10 ml metanolo Purificazione MCAC + SPE polimerica C18 Evaporazione e ripresa con fase mobile HPLC metodo di analisi multiresiduo HPLC-DAD campo di misura 1 15 mg/kg.

16 L approccio analitico TETRACICLINE 2. Verifica del carry-over Analisi quantitativa: interpolazione su retta di taratura in matrice ante. Effetto matrice: corretto mediante standard interno per la determinazione quantitativa (area relativa). Recupero: concentrazione corretta per il recupero Incertezza di misura estesa del risultato: U = 20%

17 L approccio analitico PENICILLINE 1. Verifica del titolo in p.a. 2. Verifica del carry-over La ricerca non era prevista nel progetto, perché laboratorio del C.Re.A.A. non dispone di metodi di prova. In fase di campionamento sono stati individuati due casi ritenuti molto interessanti, per i quali è stata aggiunta la richiesta di AMOXICILLINA. Le analisi sono state effettuate presso il laboratorio di IZS LER Brescia. il

18 Messa a punto dei metodi Il laboratorio utilizza in routine un metodo accreditato per la ricerca di sulfamidici al carry-over e uno per la determinazione di tetracicline alle dosi di utilizzo. Nel 2014 è stato sviluppato e validato presso il laboratorio il metodo analitico per ricerca di tetracicline a livello di carryover. Nel 2015 è stato sviluppato presso il laboratorio il metodo analitico per ricerca di sulfamidici al titolo.

19 Validazione dei metodi Regulation (EC) n. 882 / 2004 annex 3 La validazione è stata condotta prendendo in considerazione i seguenti parametri: - linearità della risposta - specificità - recupero / esattezza - ripetibilità, riproducibilità intralaboratorio - LOD, LOQ - Robustezza - incertezza di misura FEED

20 Esecuzione delle analisi ELENCO CAMPIONI ID P.A. TITOLO P1 OTC 1500 P2 CTC 800 P3 DOSSI 400 P4 SDZ 2400 P5 CTC 800 P6 SDZ 400 P7 SDM + CTC P8 DOSSI 400 P9 OTC 1500 P10 AMOXI 450 P11 OTC 1000 P12 SDZ 688 P13 OTC 1400 P14 OTC 1500 P15 SDM + CTC P16 OTC 2000 P17 SDM + CTC P18 AMOXI 272 P19 CTC 800 P20 CTC 600 P21 SDM + CTC P22 SDZ 2400 P23 CTC 400 P24 CTC 800 P25 CTC 1000 Le analisi sono state eseguite nel periodo maggio-ottobre Sono stati campionati: - 6 casi per ossitetraciclina (OTC) - 11 casi per clortetraciclina (CTC) - 2 casi per dossiciclina (DOSSI) - 2 casi per amoxicillina (AMOXI) - 4 casi per sulfadiazina (SDZ) - 4 casi per sulfadimetossina (SDM). In totale sono stati analizzati: -176 subcampioni per TETRACICLINE - 62 subcambpioni per SULFAMIDICI - 18 subcampioni per PENICILLINE

21 Determinazione quantitativa La quantità di p.a., espressa in mg/kg, è stata calcolata come media delle 4 repliche indipendenti: es. Prova 15 P: Q = media (P1a, P1b, P2a, P2b) Quando la differenza tra le repliche è risultata superiore al limite di ripetibilità del metodo, la prova è stata ripetuta interamente. Quando, in un dosaggio al carry-over, la quantità è risultata superiore al campo di misura del metodo, la prova è stata ripetuta interamente utilizzando il metodo del titolo, con alcune modifiche nel fattore di diluizione.

22 Sintesi dei risultati

23 Sintesi dei risultati

24 Sintesi dei risultati

25 Sintesi dei risultati

26 Sintesi dei risultati ELENCO CAMPIONI AMOXICILLINA ID P. A. DICHIARATO T A B C P Px P10 AMOXI ,6 NR P18 AMOXI ,2 NR NR 3,7 NR

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28 Grazie per l attenzionel

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