Metodo per la determinazione di Ibuprofene in acque superficiali, sotterranee e di scarico.

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1 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. Progetto EMAS di Distretto finalizzato all Attestato APO (Ambiti Produttivi Omogenei) e al supporto delle singole organizzazioni dei comparti chimico farmaceutico operanti nel territorio della provincia di Latina Metodo per la determinazione di Ibuprofene in acque superficiali, sotterranee e di scarico. Il presente documento è strettamente riservato e non può essere divulgato nè riprodotto, ancorché parzialmente, senza espressa autorizzazione scritta della società Pa.L.Mer. s.c.a r.l. Nelle copie soggette ad aggiornamento la versione sostituita deve essere distrutta e la versione originale sostituita viene contrassegnata con la dicitura SUPERATO Pa.L.Mer. società consortile a r.l. Cap. Soc ,00 - Codice Fiscale e Partita Iva Iscr. Reg. Impr. LT Iscr. R.E.A. LT Sede Legale: Via Carrara, 12/A Latina - Telefono Fax Sede di Ferentino: Via Casilina, 246 (Km. 68) Ferentino (FR) - Telefono Fax Sede di Cassino: Via Sant Angelo (Polo Univer. Folcatara) Cassino (FR) - Tel Fax

2 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. INDICE 1. Scopo e campo applicazione 2. Principio del metodo 3. Responsabilità 4. Apparecchiature, Reagenti e Materiali 5. Regolazione e ottimizzazione dello strumento 6. Taratura del sistema HPLC UV-visibile 7. Analisi del campione tal quale 7.1 Concentrazione su SPE 8. Condizioni cromatografiche 9. Calcolo dei risultati

3 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. 1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE Scopo della presente procedura è descrivere in maniera esaustiva la modalità operative per la determinazione del principio attivo IBUPROFENE, utilizzato per la produzione di molti farmaci anti-infiammatori, in campioni acquosi (es: acque superficiali, sotterranee, di scarico). Il metodo è applicabile a campioni la cui concentrazione di ibuprofene è superiore ai 0,5 µg/l. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il metodo consente la determinazione dell ibuprofene contenuto in campioni acquosi opportunamente trattati. La determinazione prevede i seguenti passaggi: Introduzione della soluzione da analizzare, preventivamente trattata, in HPLC. Rivelazione UV- visibile a 214 nm Determinazione quantitativa dopo la taratura effettuata con opportune soluzioni standard. 3. RESPONSABILITA La responsabilità di eseguire le operazioni descritte nella presente procedura è del personale del laboratorio debitamente addestrato e autorizzato per questa prova.

4 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. 4. APPARECCHIATURE, REAGENTI E MATERIALI Per le operazioni il laboratorio utilizza le seguenti apparecchiature, campioni di riferimento e reagenti: Acqua bidistillata Metanolo, Acetone, Diclorometano, Acetonitrile di grado per HPLC Soluzione Acetonitrile:Metanolo 90:10 Standard certificato di ibuprofene Colonnine STRATA-X 33u Polymeric Reversed Phase 200 mg/3 ml o equivalenti Sistema HPLC con detector UV- visibile Colonna per HPLC: Zorbax SB C18, 5 µm 4.6*150 mm o equivalente Fase mobile A per HPLC: 0.1 % Acido Ortofosforico in acqua Fase mobile B per HPLC: Acetonitrile/Metanolo 90:10 Sistema da vuoto Rotavapor Vetreria di classe A 5. REGOLAZIONI ED OTTIMIZZAZIONI DELLO STRUMENTO L ottimizzazione e la regolazione dello strumento vanno condotte secondo quanto descritto nel manuale d uso dello strumento.

5 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. 6. TARATURA DEL SISTEMA HPLC UV-VISIBILE La retta di taratura viene effettuata preparando delle soluzioni a diversa concentrazione a partire da standard certificati. Preparare una soluzione madre di Ibuprofene circa100 mg/l in acetonitrile:metanolo 90:10 stabile per tre mesi se conservata a 4 ± 1 C. Da tale soluzione preparare, per diluizione con Acetonitrile/Metanolo 90:10, soluzioni ad almeno cinque diverse concentrazioni note in un range compreso tra 10 µg/l e 10 mg/l. La retta di taratura sarà determinata dall area ottenuta dalla media di almeno tre iniezioni per ogni concentrazione. 7. ANALISI DEL CAMPIONE TAL QUALE. Filtrare il campione su filtro da 0,45 µm direttamente in una vial da 2 ml. Iniettare seguendo le condizioni cromatografiche descritte di seguito. Per valori superiori a 10 mg/l è necessario diluire il campione affinché la concentrazione letta dallo strumento rientri nel range della retta di taratura. Per valori inferiori a 50 µg/l è necessario effettuare una estrazione su colonnine SPE come descritto di seguito. 7.1 ESTRAZIONE SPE Filtrare circa 100 ml del campione su filtro da 0,45 µm e raccogliere il filtrato in cilindro graduato. Attivare la colonnina STRATA-X 33, precedentemente collocata sul sistema da vuoto, con circa 3 ml di metanolo ad un flusso di circa 1mL/min. Sciacquare con circa 3 ml di acqua, quindi far passare il campione. Al termine sciacquare con altri 3 ml di acqua distillata e lasciar asciugare la colonnina. Eluire l adsorbato con Acetone (circa 3 ml) e Diclorometano (circa 3mL) in ampolla a cuore di volume 50 ml. Ridurre il volume con rotavapor ad una temperatura di 35 C fino a circa 1 ml finire di portare a secco sotto leggero flusso di N 2.

6 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. Il campione viene ripreso con 1 ml della fase mobile Acetonitrile: Metanolo 90:10 e filtrato con filtro da 0,45 µm in una vial con insert ed iniettato per l analisi cromatografica. 8. CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE L analisi cromatografica viene effettuata utilizzando un cromatografo ad alta risoluzione corredato con colonna Zorbax SB C18. Le condizioni ottimali prevedono un volume di iniezione di 100 µl con un flusso di 2 ml /min. L eluizione avviene in modalità isocratica avente le seguenti fasi mobili: Fase mobile A: 60% (0,1% H 3 PO 4 in acqua) Fase mobile B: 40% (Acetonitrile:Metanolo 90:10) L individuazione del composto target avviene tramite rivelatore UV-visibile alla lunghezza d onda di 214 nm. 9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI La quantificazione per un campione con concentrazione superiore ai 50 µg/l avviene applicando la seguente formula: Dove: C = concentrazione di Ibuprofene nel campione espressa in µg/l A = area del picco del campione q = valore dell intercetta della retta di taratura m = valore della pendenza della retta di taratura

7 COPIA AD USO ESCLUSIVO DI. d = fattore di diluizione Nel caso in cui il campione sia stato sottoposto a concentrazione con colonnine SPE si applica la seguente formula: Dove: C = concentrazione di Ibuprofene nel campione espressa in µg/l C = concentrazione ricavata dalla retta di taratura espressa in µg/l f a = fattore di arricchimento dato dalla formula: o V f = volume di fase mobile utilizzata per riprendere il campione espressa in ml o V i = volume di campione trattato su colonnine espresso in ml.

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