INTRODUZIONE. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N

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1 AMFETAMINE urinarie in GC/MS Cod. GC00 (Amfetamina, Metamfetamina,,-MDMA,,-MDA,,-MDE, Efedrina, Pseudoefedrina, Norpseudoefedrina, MBDB) Metodo di conferma in GC-MS INTRODUZIONE Le Amfetamine sono droghe sintetiche psicoattive con una lunga storia di uso ed abuso. La loro determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografia sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector di Massa (MS). Il presente metodo consente di determinare la Amfetamina, la Metamfetamina, la,-mdma, la,-mda, la,-mde, l Efedrina, la Pseudoefedrina, la Norpseudoefedrina e l MBDB con lettura in GC/MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 070 Head Quarter: Via Enrico Fermi 600 Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 00 Amfetamine urinarie in GC/MS Dicembre 00

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare l Amfetamina, la Metamfetamina, il,-mdma (Ecstasy), il,- MDA, il,-mde, l Efedrina, la Pseudoefedrina, la Norpseudoefedrina e la MBDB urinari previa estrazione SPE, derivatizzazione e lettura in GC-MS. Recupero del Metodo : Amfetamina 98%,-MDE 9 Metamfetamina 98% Efedrina 98%,-MDMA 98% Pseudoefedrina 98%,-MDA 98% Norpseudoefedrina 98% MBDB 87% Sensibilità del Metodo : 0,0 ng/ml Range dinamico del metodo : ng/ml Valore di cut-off: Amfetamina 0 ng/ml Metamfetamina 0 ng/ml,-mdma 0 ng/ml,-mda 0 ng/ml,-mde 0 ng/ml Efedrina 0 ng/ml Pseudoefedrina 0 ng/ml Norpseudoefedrina 0 ng/ml MBDB 0 ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 0 ottobre 007 Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a 8 C. Reagente A Soluzione Tampone, x 00 ml Reagente B Soluzione di Condizionamento N, x 00 ml Reagente C Soluzione di Condizionamento N, x 00 ml Reagente D Soluzione di Lavaggio N, x 00 ml Reagente E Soluzione di Lavaggio N, x 00 ml Reagente F Soluzione di Lavaggio N, x 00 ml Reagente G Soluzione Eluente, x 00 ml Reagente H Soluzione Derivatizzante, x 0 ml Reagente I Soluzione Derivatizzante, x ml Reagente J Soluzione Test, x 0, ml Vedi Avvertenze Reagente K Soluzione Standard Interno, x 00 µl Reagente L liofilo urinario Livello, x ml Reagente L liofilo urinario Livello, x ml Reagente L liofilo urinario Livello, x ml Reagente L liofilo urinario Livello, x ml Reagente L liofilo urinario Livello, x ml Reagente M Standard Chimico MBDB, x ml Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Colonne di Clean up, 00 pz

3 Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Modalità di prelievo urinario : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Prelevare 0 ml urina Stabile per circa mesi a 0 C

4 PROCEDURA PREANALITICA: FASE : In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 00 µl di Reagente J Soluzione Test 0 µl di Reagente K Soluzione Standard Interno Portare a secco con un l ausilio di un flusso di Elio o di Azoto. FASE : Riprendere con 00 µl di Reagente H Soluzione Derivatizzante Al vortex per 0 secondi FASE : Porre in stufa a 80 C per minuti Lasciar raffreddare FASE : Riprendere con 0 µl di Reagente I Soluzione Derivatizzante FASE : Porre in stufa a 80 C per minuti Al vortex per 0 secondi FASE 6 : Trasferire tutto il campione nelle vials con riduttore di volume NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione delle Amfetamine che deve essere simile a quello riportato nelle Fig. sottostanti. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA: Diluire il Reagente K Soluzione Standard Interno :0 con Acqua di grado HPLC, preparando il volume sufficiente per coprire i campioni della seduta analitica. N.B.: tale diluizione va preparata fresca ad ogni seduta analitica FASE : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento N Scartare l eluato Versare in colonna ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento N Scartare l eluato Release N 00 Amfetamine urinarie in GC/MS Dicembre 00

5 FASE : Preparazione dei campioni Fare la curva di Calibrazione su punti: Reagente L liofilo urinario Livello Reagente L liofilo urinario Livello Reagente L liofilo urinario Livello Reagente L liofilo urinario Livello Reagente L liofilo urinario Livello Reagente M Std Chimico MBDB Campione Controlli Reagente A Soluzione Tampone Reagente K Sol. Std Interno (diluito :0 in Acqua grado HPLC) Livello,0 ml Livello,0 ml Livello,0 ml Livello,0 ml Livello,0 ml Std Chimico MBDB,0 ml Campione Controlli,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml,0 ml 0 µl 0 µl 0 µl 0 µl 0 µl 0 µl 0 µl Al vortex per 0 secondi FASE : Versare tutti i campioni precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di ml/ minuto. FASE : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria Lavare con ml di Reagente E Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria Lavare con ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE : Aggiungere,0 ml di Reagente G - Soluzione Eluente rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Portare a secco con un l ausilio di un flusso di Elio o di Azoto. Release N 00 Amfetamine urinarie in GC/MS Dicembre 00

6 FASE 6 : Riprendere con 00 µl di Reagente H Soluzione Derivatizzante Al vortex per 0 secondi FASE 7 : Porre in stufa a 80 C per minuti Lasciar raffreddare FASE 8 : Riprendere con 0 µl di Reagente I Soluzione Derivatizzante FASE 9 : Porre in stufa a 80 C per minuti Al vortex per 0 secondi FASE 0 : Trasferire tutto il campione nelle vials con riduttore di volume INIEZIONE : Iniettare µl della soluzione nel GC N.B.: i campioni vanno iniettati subito, non possono essere congelati per analisi differite. Release N 00 Amfetamine urinarie in GC/MS Dicembre 00 6

7 AMFETAMINE urinarie - Avvertenze REAGENTE J: SOLUZIONE TEST Amfetamine Metamfetamine,-MDMA,-MDA,-MDE Efedrina Pseudoefedrina Norpseudoefedrina MBDB circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml circa.000 ng/ml REAGENTI L-L-L-L-L : CALIBRATORE LIOFILO URINARIO Amfetamine Metamfetamine,-MDMA,-MDA,-MDE Efedrina Pseudoefedrina Norpseudoefedrina Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente ml di H O di grado HPLC e agitare delicatamente per 0 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 6 mesi se conservati a 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 8 C e mese a 0 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. Livello Livello Livello Livello Livello REAGENTE M: STANDARD CHIMICO MBDB MBDB SETTAGGIO DEL GAS-CROMATOGRAFO : Colonna VF-ms 0 m x 0, mm, 0, µm (condizionata) Temperatura iniettore 0 C Rapporto di Splittaggio Inizio: ON split 0 0 min: OFF min: ON split 00 min: ON split 0 Temperatura 70 C x. minuti + 0 C/min fino a 90 C + 0 C/min fino a 0 C x 0 minuti (corsa. minuti) Flusso in colonna: ml/min SETTAGGIO DETECTOR DI MASSA (000) : Range di Massa 0 0 Temperatura della Massa: 80 C; Temperatura Transfer Line: 70 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: minuti 7

8 CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA VF-ms, DELLA SIRINGA E DEL LINER Per la colonna seguire le prescrizioni del costruttore. All inizio di ogni seduta analitica effettuare la calibrazione delle masse e delle RF. PULIZIA DELLA COLONNA Iniettare ACETONE prima e dopo la seduta analitica. Lavare la siringa prima dell iniezione con ACETONE. Al termine di ogni seduta analitica effettuare la pulizia del Liner dell iniettore ed eseguire il backout della trappola ionica. Al termine di ogni seduta analitica portare il gradiente alla massima temperatura della colonna (consigliata dal costruttore) con velocità di 0 C/minuto. Vedere istruzioni del costruttore PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC06 urinario per Amfetamine x x ml CC07 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 6 x ml CC08 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 6 x ml CC09 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli e x 6 x ml Z0 Standard Chimico urinario per MBDB x ml Z99800 Vial standard di vetro da ml con tappo a vite x Pz S969 Riduttori di volume per vials da ml x 00 Pz 8

9 7 AMPHETAMINE TMS TFA 0 Cs 000ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 8. (.e+6=0), 0 cs 000ng- amf_-6-00.sms 8..e min, Scan: 69,, Ion: 76 us, RIC: 6.8e+6, BC 6 0..e+6 7% AMPHETAMINE TMS TFA 0 Cm 00ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered % Fig. : Campione urinario Amfetamina Fig. : Spettro di Massa Amfetamina R.T AMFETAMINA IONI MOLECOLARI:

10 6 METAMPHETAMINE TMS TFA 0 Cs 000ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP:. (.9e+6=0), 0 cs 000ng- amf_-6-00.sms 7.00 min, Scan: 7,, Ion: 9 us, RIC:.0e+7, BC..9e+6 7% 0..07e METAMPHETAMINE TMS TFA 0 Cm00ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered 8..7e e+6 % Fig. : Campione urinario Metamfetamina Fig. : Spettro di Massa Metamfetamina R.T. 7.0 METAMFETAMINA IONI MOLECOLARI:

11 7 NORPSEUDOEFEDRINA TMS TFA Cs 000ng- EFE_-7-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 79. (.9e+6=0), cs 000ng- efe_-7-00.sms 7.77 min, Scan: 807,, Ion: 6 us, RIC:.0e+7, BC 79..9e+6 6 7% 7..9e+6 7 NORPSEUDOEFEDRINA TMS TFA Cm 00ng- EFE_-6-00.SMS () Filtered 6 % Fig. : Campione urinario Norpseudoefedrina Fig. 6 : Spettro di Massa Norpseudoefedrina R.T NORPSEUDOEFEDRINA IONI MOLECOLARI: 7-79

12 EFEDRINA TMS TFA Cs 000ng- EFE_-7-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 79. (.9e+6=0), cs 000ng- efe_-7-00.sms 7.77 min, Scan: 807,, Ion: 6 us, RIC:.0e+7, BC 79..9e+6 7% 7..9e+6 EFEDRINA TMS TFA Cm 00ng- EFE_-6-00.SMS () Filtered % Fig. 7 : Campione urinario Efedrina Fig. 8 : Spettro di Massa Efedrina R.T EFEDRINA IONI MOLECOLARI: 7-79

13 . PSEUDOEFEDRINA TMS TFA Cs 000ng- EFE_-7-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 79. (.9e+6=0), cs 000ng- efe_-7-00.sms 7.77 min, Scan: 807,, Ion: 6 us, RIC:.0e+7, BC 79..9e %. 7..9e PSEUDOEFEDRINA TMS TFA Cm 00ng- EFE_-6-00.SMS () Filtered..0. % Fig. 9 : Campione urinario Pseudoefedrina Fig. 0 : Spettro di Massa Pseudoefedrina R.T. 8.0 PSEUDOEFEDRINA IONI MOLECOLARI: 7-79

14 . A MDA TMS TFA 0 Cs 000ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered Spectrum A BP:. (9670=0), 0 cs 000ng- amf_-6-00.sms min, Scan: 9,, Ion: us, RIC:.078e+6, BC.0. 7% MDA TMS TFA 0 Cm 00ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered % Fig. : Campione urinario,-mda Fig. : Spettro di Massa,-MDA R.T. 8.0,-MDA IONI MOLECOLARI: -6-7

15 MDMA TMS TFA 0 Cs 000ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 6. (.86e+6=0), 0 cs 000ng- amf_-6-00.sms 9.96 min, Scan: 06,, Ion: 7 us, RIC: 7.70e+6, BC 6..86e+6..0e+6 7% MDMA TMS TFA 09 Cm 00ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered % Fig. : Campione urinario,-mdma Fig. : Spettro di Massa,-MDMA R.T. 9.0,-MDMA IONI MOLECOLARI: 0---6

16 MDE TMS TFA 0 Cs 000ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 68. (.98e+6=0), 0 cs 000ng- amf_-6-00.sms 9.77 min, Scan: 6,, Ion: 8 us, RIC:.8e+7, BC e %. 0.0 MDE TMS TFA 09 Cm 00ng- AMF_-6-00.SMS () Filtered 0..98e % Fig. : Campione urinario,-mde Fig. 6 : Spettro di Massa,-MDE R.T. 9.0,-MDE IONI MOLECOLARI:

17 .0 MBDB TMS TFA Cs 000ng- EFE_-7-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 76. (79=0), cs 000ng- efe_-7-00.sms 9.67 min, Scan:,, Ion: us, RIC:.87e+6, BC % MBDB TMS TFA Cm00ng- EFE_-6-00.SMS () Filtered % Fig. 7 : Campione urinario MBDB Fig. 8 : Spettro di Massa MBDB R.T. 9.6 MBDB IONI MOLECOLARI:

18 kcounts 800 MDPA TMS TFA Cs 000ng- EFE_-7-00.SMS () Filtered A 0 Spectrum A BP: 0. (08967=0), cs 000ng- efe_-7-00.sms 9.98 min, Scan: 96,, Ion: 08 us, RIC: 7906, BC % % Fig. 9 : Campione urinario Standard Interno Fig. 0 : Spettro di Massa Standard Interno R.T. 9.9 STANDARD INTERNO IONI MOLECOLARI:

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