BENZOILECGONINA (Metabolita della Cocaina) - COCAETILENE - COCAINA urinarie in GC-MS Cod. GC Metodo di conferma GC-MS

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1 BENZILECGNINA (Metabolita della Cocaina) - CCAETILENE - CCAINA urinarie in GC-MS Cod. GC6 Metodo di conferma GC-MS INTRDUZINE La Cocaina, sostanza d abuso psicostimolante, è un alcaloide che si ottiene dalle foglie della coca (Erythroxylum Coca), pianta originaria del sud America, per estrazione di queste con idrossido di calcio o ammoniaca. All interno dell organismo, la cocaina viene rapidamente idrolizzata a Benzoilecgonina. Questo metabolita viene escreto nell urina e la sua determinazione in questo liquido biologico è prova di assunzione di cocaina. Le metodiche di screening misurano, attraverso una reazione antigene-anticorpo, la Benzoilecgonina. Poiché queste metodologie possono dare falsi risultati positivi per la presenza di sostanze estranee che eventualmente interferiscono nella reazione antigene-anticorpo, è sempre necessaria un analisi di conferma. Quindi qualora l analisi di screening risulti positiva (cut off = ng/ml) è necessaria un analisi di conferma, generalmente con tecnica cromatografica sia gassosa che liquida entrambe accoppiate con un rivelatore in spettrometria di massa. Inoltre nei liquidi biologici dei soggetti assuntori sia di cocaina che di alcol è possibile determinare il metabolita cocaetilene. Il presente metodo consente di determinare sia la cocaina, ove eventualmente presente, la benzoilecgonina e la cocaetilene urinari previa estrazione delle sostanze dalla matrice urinaria in colonne di estrazione in fase solida e successiva determinazione in gas cromatografiaspettrometria di massa. EUREKA srl LAB DIVISIN VAT N 7 info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 6 Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 7 Benzoilecgonina Cocaetilene - Cocaina urinarie in GC/MS Luglio

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Benzoilecgonina, il maggiore metabolita della Cocaina, la Cocaetilene e la Cocaina previa estrazione in fase solida (Solid Phase Estraction, SPE) e lettura in Gas Cromatografia Spettrometria di Massa (GC-MS). Il metodo è stato validato secondo i criteri stabiliti a livello internazionale dalla FDA e dall ICH. ANALITA (Coefficiente di correlazione R) + deviazione standard LD (ng/ml) LQ (ng/ml) BEG,9979 ±, CCAETILENE,9977 ±,6 8 CCAINA,9986 ±, 6 ANALITA Accuratezza intra-giorno Precisione inter-giorno Accuratezza inter-giorno (Errore %) (CV%) (Errore %) Calibratore Calibratore Calibratore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore BEG 8,6,66 6,7,,7,,6,87 CCAETILENE 8,8 7,,9 9, 9,6,,9,8 CCAINA 7,,7,9,9,6,9,,9,87 ANALITA Recupero (%) Calibratore Inferiore Medio Superiore BEG 78, 8,9 9,7 CCAETILENE 6, 9,9,7 CCAINA 8,6 9,99, La tabella sottostante riporta, per ogni analita, le concentrazioni corrispondenti ai Calibratori i cui valori Inferiore, Medio e Superiore citati sopra fanno riferimento. ANALITA Concentrazioni ng/ml Calibratore Inferiore Medio Superiore BEG 7,,, CCAETILENE 7,,, CCAINA 7,,,

3 Valore di cut-off Benzoilecgonina, Cocaina, Cocaetilene: ng/ml Rif. Gazzetta Ufficiale n 6 8 ott 8 Contenuto della Confezione ( test): Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a 8 C. Reagente A Soluzione Condizionamento e Lavaggio, x ml Reagente B Soluzione Condizionamento, x ml Reagente C Soluzione Tampone, x ml Reagente D Soluzione Lavaggio, x ml Reagente E Soluzione Eluente, x ml Reagente F Soluzione Diluente, x ml Reagente H Soluzione Test Benzoilecgonina, x, ml Reagente I Soluzione Test Cocaetilene, x, ml Reagente K Soluzione Test Cocaina, x, ml Reagente J Soluzione Standard interno, x µl Reagente P Calibratore liofilo urinario - Livello, x ml Reagente P Calibratore liofilo urinario - Livello, x ml Reagente P Calibratore liofilo urinario - Livello, x ml Reagente P Calibratore liofilo urinario - Livello, x ml Reagente P Calibratore liofilo urinario - Livello, x ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, x ml ( ampolle da ml) Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Confezionati nell apposita scatolina Vedi Avvertenze Confezionati nell apposita scatolina Vedi Avvertenze Confezionati nell apposita scatolina Vedi Avvertenze Confezionati nell apposita scatolina Vedi Avvertenze Confezionati nell apposita scatolina Vedi Avvertenze - Per il prelievo del Reagente M, utilizzare la siringa Hamilton da ul Cod. Z8 Colonne per estrazione SPE, pz Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Modalità di prelievo urinario : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Prelevare ml urina NB: Qualora l analisi non venga immediatamente eseguita, l urina, previamente aliquotata nel rispetto della catena di custodia, deve essere conservata a - C. Il tempo di conservazione a - C va verificato da parte del laboratorio con opportune prove di stabilità su differenti aliquote di uno stesso campione urinario arricchito con la sostanza d abuso. La letteratura internazionale riporta che le principali sostanze d abuso non subiscono una degradazione statisticamente significativa nell arco dei -6mesi, se mantenute a condizioni controllate a - C.

4 . PRCEDURA PREANALITICA : FASE : In una provetta di vetro con tappo a vite in teflon pipettare : µl di Reagente F Sol. Diluente µl di Reagente H Soluzione Test Benzoilecgonina µl di Reagente I Soluzione Test Cocaetilene µl di Reagente K Soluzione Test Cocaina Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per secondi FASE : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < C). FASE : Riprendere con µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante utilizzando l apposita siringa Hamilton da µl (cod. Z8) FASE : Porre in stufa a 7 C per minuti Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per secondi Raffreddare a Temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro FASE : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume per per autocampionatore. NTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare µl della soluzione appena preparata in GC per identificare il tempo di ritenzione e lo spettro di massa sia per la Benzoilecgonina che per la Cocaetilene che per la Cocaina. Essi devono essere simili a quelli riportati nelle Figure sottostanti. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PRCEDURA ANALITICA : FASE : Condizionamento delle colonnine SPE Preparare un numero di colonnine corrispondenti alla somma dei calibratori, controlli e campioni incogniti Aggiungere, ml di Reagente A Soluzione di Condizionamento e Lavaggio Far passare in colonnina e scartare l eluato Aggiungere ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento Far passare in colonnina e scartare l eluato Release N 7 Benzoilecgonina Cocaetilene - Cocaina urinarie in GC/MS Luglio

5 FASE : Preparazione dei Calibratori, Controlli e Campioni incogniti Il reagente J è costituito da µl di Standard Interno e va diluito : in H prima dell utilizzo. Poiché sono necessari µl per ogni campione analizzato e per ogni campione del test di validazione, bisogna calcolare il volume necessario per ogni seduta analitica e contemporaneamente diluire il reagente. ES. per una seduta analitica con campioni incogniti e calibratori sono necessari µl di reagente J diluito. Pertanto si prelevano µl di reagente J e si diluiscono con 9 µl di H. Al vortex per almeno sec. La soluzione è ora pronta per l uso. Il reagente J non diluito e non utilizzato si richiude ermeticamente e si conserva la quantità residua in congelatore a - C. Inserire in un porta provette un numero di tubi in vetro corrispondente ai calibratori, controlli ed n campioni incogniti. In ogni tubo inserire il volume di calibratori, controlli e campioni incogniti indicato nella tabella sottostante. Campione Calibratore Calibratore Calibratore Calibratore Controllo INCGNIT Livello Livello Livello Livello Livello Campione µl Reagente P µl Calibratore liofilo urinario - Livello Reagente P µl Calibratore liofilo urinario Livello Reagente P µl Calibratore liofilo urinario Livello Reagente P µl Calibratore liofilo urinario Livello Reagente P µl Calibratore liofilo urinario Livello Controllo µl Reagente J Sol. Std µl µl µl µl µl µl µl interno (diluito come sopra indicato) Reagente C Sol. Tampone µl µl µl µl µl µl µl Controllare che il ph sia 6, con cartine indicatrici di ph (immergere la punta di una pipetta pasteur o di un puntale nel tubo; utilizzare una pipetta diversa per ogni tubo). Nel caso eventuale (<% dei campioni incogniti) che il ph non sia compreso tra. e., si possono effettuare delle correzioni con pochi ul di HCl. M o NaH. M miscelando e ricontrollando il ph dopo ogni aggiunta. N.B: Qualora si volesse determinare anche la cocaina, è necessario preparare la curva di calibrazione su punti utilizzando gli appositi liofili (cod. CC66) che non sono inclusi nel kit ma che sono fornibili a parte. Per la loro preparativa è sufficiente utilizzare la stessa modalità dei reagente P, P, P, P, P della tabella sopra riportata. Agitare al Vortex Release N 7 Benzoilecgonina Cocaetilene - Cocaina urinarie in GC/MS Luglio

6 FASE : Aggiungere i calibratori, i controlli ed i campioni incogniti, preparati nella fase, nelle colonnine condizionate e scaricare ad un flusso di ml/ minuto (goccia a goccia) anche con l ausilio di un vuoto moderato. FASE : Lavaggio delle colonne SPE: Lavare con ml di Acqua di grado HPLC (non fornita nel kit) Far passare in colonnina e scartare l eluato Lavare con ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio Far passare in colonnina e scartare l eluato Lavare con ml di Reagente A Soluzione Condizionamento e Lavaggio Far passare in colonnina, scartare l eluato e portare a secco la colonnina SPE con un leggero flusso d aria FASE : Eluizione rigorosamente in provette di vetro in pyrex con tappo Portare a secco con un leggero flusso d aria Eluire con ml di Reagente E Soluzione Eluente Raccogliere l eluato nelle provette di vetro pyrex ed agitare al vortex FASE 6 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < C). FASE 7 : Riprendere con µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante utilizzando l apposita siringa Hamilton da µl (cod. Z8) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per secondi FASE 8: Porre in stufa a 7 C per minuti Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 9 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume INIEZINE : Iniettare µl della soluzione nel GC Release N 7 Benzoilecgonina Cocaetilene - Cocaina urinarie in GC/MS Luglio 6

7 BENZILECGNINA - CCAETILENE CCAINA urinarie - Avvertenze REAGENTE H: SLUZINE TEST BENZILECGNINA Benzoilecgonina Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a - C. circa. ng/ml REAGENTE I: SLUZINE TEST CCAETILENE Cocaetilene Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a - C. circa. ng/ml REAGENTE K: SLUZINE TEST CCAINA Cocaina Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a - C. circa. ng/ml REAGENTE J: SLUZINE STANDARD INTERN Propilbenzoilecgonina Conservazione: il reagente va stoccato a C mg/ml REAGENTE P-P-P-P-P: CALIBRATRE LIFIL URINARI Lot BENZILECGNINA CCAETILENE Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente ml di H di grado HPLC e agitare delicatamente per min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 6 mesi se conservati a 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 8 C e mese a C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x x ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. Liv. ng/ml Liv. ng/ml,, Liv. ng/ml 96, 9,7 Liv. ng/ml,, Liv. ng/ml 9, 9, REAGENTE M: SLUZINE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a -8 C. CNDIZINI DETECTR DI MASSA () : (tali condizioni possono essere variate in funzione dello strumento utilizzato) Range di Massa 78 m/z Temperatura della Massa: 8 C; Temperatura Transfer Line: 7 C; Temperatura Manifold: 8 C Filamento on: minuti 7

8 CNDIZINI DEL GAS-CRMATGRAF : (tali condizioni possono essere variate in funzione dello strumento utilizzato) Colonna VF-ms m x, mm,, µm (dopo averla condizionata seguendo le indicazioni del fornitore) Temperatura iniettore 8 C Rapporto di Splittaggio Inizio: N split min: FF min: N split min: N split NB: Il rapporto di splittaggio può essere variato a seconda dello strumento utilizzato Programmata Termica: C x, minuti - C a C/min C x minuto, - C a C/min C x minuti (corsa minuti) Flusso Gas Elio ml/min CNDIZINAMENT DELLA CLNNA VF- MS Seguire le prescrizioni del costruttore. PULIZIA DELLA CLNNA VF- MS Qualora le performance analitiche subiscano rilevanti modifiche (es. scarsa sensibilità o presenza di interferenti nei cromatogrammi), è necessario effettuare la pulizia della colonna come riportato secondo le indicazioni del fornitore. LAVAGGI DELL AUTCAMPINATRE Lavare la siringa prima di ogni iniezione con ACETNE. PARAMETRI CMPUTER GESTINALE SECND LE SPECIFICHE DEL SFTWARE GESTINALE ACCESSRI E CNSUMABILI CDICE DESCRIZINE CNFEZINE CC66 Calibratore urinario per Benzoilecgonina e Cocaetilene x x ml CC66 Calibratore urinario per Cocaina x x ml CC7 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 6 x ml CC8 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 6 x ml CC9 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli e x 6 x ml CC87 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinarie Livello 6 x ml CC88 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinarie Livello 6 x ml CC89 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinarie Livelli e x 6 x ml S97U Vial standard di vetro da ml con tappo a vite x Pz S77 Riduttori di volume per vials da ml x Pz. 8

9 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) Cocaetilene - Cocaina urinarie (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS).. Beg TMS Ci 7ng-_--.SMS Ions:. Filtered % BP 8. (999=%) 8 in MAINLIB Benzoylecgonine-TMS C9H7NSi, MW6.... Beg TM S.9 m in Beg TMS Cm ng-_--.sms Ions:. Filtered 7% N Si.. %.. Beg TM S.86 m in Beg TMS 6 ULQ ng-_--.sms Ions:. Filtered Beg TM S.88 m in % % minutes m/z Fig. : Campioni urinari Benzoilecgonina Fig. : Spettro di Campioni urinari Benzoilecgonina R.T..9 Benzoilecgonina 7 ng/ml INI MLECLARI :

10 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) Cocaetilene - Cocaina urinarie (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) CCAETILENE Ci 7ng-_--.SMS Ions: Filtered % BP 8. (999=%) in EUREKA CCAETILENE CCAETILENE.9 m in CCAETILENE Cm ng-_--.sms Ions: Filtered 7% CCAETILENE.8 m in CCAETILENE 6 ULQ ng-_--.sms Ions: Filtered CC AETI.8 m in % % % minutes m/z Fig. : Campioni urinari Cocaetilene Fig. : Spettro di Campioni urinari Cocaetilene R.T..9 Cocaetilene 7 ng/ml INI MLECLARI :

11 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) Cocaetilene - Cocaina urinarie (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) CCAINA-TMS Ci 7ng-_--.SMS Ions: Filtered % BP 8. (999=%) 6 in REPLIB Cocaine CAS No. -6-, C7HN, MW N CCAINA-TMS. m in CCAINA-TMS Cm ng-_--.sms Ions: Filtered 7% 8. 6 H H CCAINA-TMS. m in % 8. 9 CCAINA-TM. m in CCAINA-TMS 6 ULQ ng-_--.sms Ions: Filtered % % minutes m/z Fig. : Campioni urinari Cocaina Fig. 6 : Spettro di Campioni urinari Cocaina R.T.. Cocaina 7 ng/ml INI MLECLARI :

12 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) Cocaetilene - Cocaina urinarie (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) PRPILBENZILECGNINA-TMS Ci 7ng-_--.SMS Ions:.+8. Filtered. RRF PR PILBENZILE CG NIN A-TM S.98 min % BP 8. (999=%) 86 in MAINLIB N Propylbenzoylecgonine CAS No , C9HN, MW 7%. RRF PRPILBENZILECGNINA-TMS.97 min PRPILBENZILECGNINA-TMS Cm ng-_--.sms Ions:.+8. Filtered % PRPILBENZILECGNINA-TMS 6 ULQ ng-_--.sms Ions:.+8. Filtered. R RF PRPILBENZILECGNINA-TM.97 m in minutes % % m/z 7.. Fig. 7 : Campioni urinari Standard Interno Fig. 6 : Spettro di Massa dello Standard Interno R.T..98 STANDARD INTERN INI MLECLARI : 8 -