Sostanze d Abuso urinarie in LC-MS Cod. LC Metodo di conferma in LC-MS

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1 in LC-MS Cod. LC74010 Metodo di conferma in LC-MS INTRODUZIONE La determinazione delle sostanze d abuso nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata in prima istanza usando tecniche immunometriche che si avvalgono della reazione antigene-anticorpo e successiva marcatura con vari reagenti. Queste metodologie sono considerate di screening. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector di Massa (MS). Il presente metodo consente di determinare la Morfina, la Diidrocodeina, la Codeina, l Etilmorfina, la 6-Monoacetilmorfina, il 3,4-MDA, il 3,4-MDE, il 3,4-MDMA, la Benzoilecgonina, la Cocaina, il Metadone, l EDDP, l Amfetamina, la Metamfetamina, la Norbuprenorfina, la Buprenorfina, la Cocaetilene, l Efedrina, la Pseudoefedrina, la Norpseudoefedrina, l MBDB ed il delta-9-thc-cooh con lettura in LC-MS. La presente metodica consente il dosaggio di altre molecole su matrice urinaria, quali Normorfina, Norcodeina, Ossicodone, Diacetilmorfina e Ketamina. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 010 Sostanze d Abuso in LC/MS Novembre

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare un ampio pacchetto di Sostanze d abuso urinarie dopo una semplice idrolisi e lettura in LC-MS. Recupero del Metodo : 100 % Sensibilità del Metodo : Oppiacei, Cocaina e metaboliti, Metadone e metabolita, Amfetamine e metaboliti 10,0 ng/ml Delta-9-THC e Norbuprenorfina 1,0 ng/ml Range dinamico del Metodo : ng/ml ng/ml THC Buprenorfina Norbuprenorfina Valore di cut-off: Morfina 100 ng/ml Diidrocodeina 100 ng/ml Codeina 100 ng/ml Etilmorfina 100 ng/ml 6-Monoacetilmorfina 100 ng/ml Metamfetamina 250 ng/ml Amfetamina 250 ng/ml 3,4-MDA 250 ng/ml 3,4-MDMA 250 ng/ml 3,4-MDE 250 ng/ml delta-9-thc-cooh 15 ng/ml Cocaetilene 100 ng/ml MBDB 250 ng/ml Norbuprenorfina 5 ng/ml Buprenorfina 5 ng/ml Benzoilecgonina 100 ng/ml Cocaina 100 ng/ml Metadone 100 ng/ml EDDP 100 ng/ml Efedrina 250 ng/ml Pseudoefedrina 250 ng/ml Norpseudoefedrina 250 ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 30 ottobre

3 Rif. LINEE GUIDA PER LE STRUTTURE DOTATE DI LABORATORI PER GLI ACCERTAMENTI DI SOSTANZE D'ABUSO CON FINALITA TOSSICOLOGICO-FORENSI E MEDICO-LEGALI SU CAMPIONI BIOLOGICI PRELEVATI DA VIVENTE Revisione n. 4 del 6 dicembre 2012 a cura della Commissione Qualità dell Associazione Scientifica Gruppo Tossicologi Forensi Italiani (GTFI) Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C, tranne il Reagente D, il Reagente F e il Reagente G che vanno stoccati a 20 C. Reagente A Soluzione per idrolisi delta-9-thc-cooh, 1 x 2 ml Reagente B Enzima di idrolisi Droghe, 2 x 1 ml Da ricostituire con 9,0 ml di Reagente C. Quando ricostituito, l enzima è stabile 1 anno a 2 8 C. Reagente C Soluzione Tampone per Idrolisi, 1 x 20 ml Reagente D Soluzione Diluente + Std interni, 1 x 150 ml Stoccare a 20 C Reagente E Soluzione Diluente per Oppiacei e delta-9-thc-cooh, 1 x 50 ml Reagente F Soluzione Standard interno per Oppiacei, 1 x 5 ml Reagente G Soluzione Standard interno per delta-9-thc-cooh, 1 x 2 ml Stoccare a 20 C Stoccare a 20 C Reagente M1 Fase Mobile M1, 1 x 500 ml Reagente M2 Fase Mobile M2, 1 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento LC-MS triplo quadrupolo con valvola Divert Analisi in gradiente binario Modalità di lavoro MRM Computer gestionale Dotazione opzionale : Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 10 ml urina Stabile per circa 3 mesi a 20 C Centrifugare le urine prima di processarle. 3

4 PROCEDURA ANALITICA PER LE DROGHE (ESCLUSO delta-9-thc-cooh, OPPIACEI e NORBUPRENORFINA): FASE 1 : In provette da 10 ml idonee dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Calibratore liofilo urinario o Standard 100 µl chimico MBDB Campione 100 µl Controlli 100 µl Reagente D Soluzione Diluente + Std interni 900 µl 900 µl 900 µl Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 5-10 µl della soluzione nel sistema LC Release N 010 Sostanze d Abuso in LC/MS Novembre

5 PROCEDURA ANALITICA SPECIFICA PER OPPIACEI e NORBUPRENORFINA: FASE 1 : Ricostituzione dell enzima Aggiungere al Reagente B Enzima di idrolisi (contenente 1 ml) 9 ml di Reagente C Soluzione Tampone per idrolisi. Agitare per inversione FASE 2 : Idrolisi del campione In provette da 10 ml idonee dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Calibratore liofilo urinario 1000 µl Campione 1000 µl Controlli 1000 µl Reagente B Enzima ricostituito 200 µl 200 µl 200 µl Reagente F Sol. Std interno per Oppiacei 50 µl 50 µl 50 µl Al vortex per 10 secondi FASE 3 : Porre in stufa a 60 C per 3 ore. Raffreddare a T ambiente FASE 4 : Prelevare 100µl di idrolizzato ed aggiungere 500 µl di Reagente E Soluzione Diluente (agitare prima dell uso) Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 5-10 µl della soluzione nel sistema LC Release N 010 Sostanze d Abuso in LC/MS Novembre

6 PROCEDURA ANALITICA SPECIFICA PER delta-9-thc-cooh: FASE 1 : Idrolisi del campione In provette da 10 ml idonee dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Calibratore liofilo urinario 500 µl Campione 500 µl Controlli 500 µl Reagente A Soluzione per idrolisi 100 µl 100 µl 100 µl delta-9-thc-cooh Reagente G Sol Std interno per delta-9-thc-cooh 20 µl 20 µl 20 µl Al vortex per 10 secondi FASE 2 : Porre in stufa a 60 C per 20 minuti. Raffreddare a T ambiente Portare a ph compreso fra 5 e 7 con circa µl di Acido Acetico glaciale FASE 3 : Prelevare 100 µl di idrolizzato ed aggiungere 500 µl di Reagente E Soluzione Diluente (agitare prima dell uso) Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 5-10 µl della soluzione nel sistema LC Release N 010 Sostanze d Abuso in LC/MS Novembre

7 CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Sostanze d Abuso urinarie - Avvertenze Installare la colonna analitica nuova Accucore C18 30 x 2,1 mm 2,6 um. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo ( 20 : 80 v/v ) al flusso di 300 ul / minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 300 ul / minuto e scaricare i primi 3 ml. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 25 C si consiglia di conservate a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. LAVAGGIO SIRINGA AUTOCAMPIONATORE Lavare la siringa, prima di ogni seduta analitica, con Metanolo. PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE Sostanze d Abuso: Standard interno da utilizzare per la calibrazione: MORFINA DIIDROCODEINA CODEINA ETILMORFINA 6-MONOACETILMORFINA METADONE EDDP NORBUPRENORFINA BUPRENORFINA 3,4-MDA MDPA 3,4-MDE MDPA 3,4-MDMA MDPA AMFETAMINA MDPA METAMFETAMINA MDPA EFEDRINA MDPA PSEUDOEFEDRINA MDPA NORPSEUDOEFEDRINA MDPA MBDB MDPA BENZOILECGONINA Atropina COCAINA Atropina COCAETILENE Atropina DELTA-9-THC-COOH Acido Mefenamico Sostanze d Abuso non comprese nel kit NORMORFINA NORCODEINA OSSICODONE DIACETILMORFINA KETAMINA MDPA 7

8 GRADIENTE Tempo (min) % M1 (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (µl/min) ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC43016 Calibratore urinario per Amfetamine 5 x 2 x 5 ml CC46016 Calibratore urinario per Benzoilecgonina e Cocaetilene 5 x 2 x 5 ml CC48016 Calibratore urinario per Metadone 5 x 2 x 5 ml CC43017 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 1 6 x 5 ml CC43018 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 2 6 x 5 ml CC43019 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml CC44016 Calibratore urinario per Buprenorfina e Norbuprenorfina 5 x 2 x 6 ml CC44017 Controllo urinario per Buprenorfina e Norbuprenorfina Livello 1 6 x 6 ml CC44018 Controllo urinario per Buprenorfina e Norbuprenorfina Livello 2 6 x 6 ml CC44019 Controllo urinario per Buprenorfina e Norbuprenorfina Livelli 1 e 2 2 x 6 x 6 ml CC45016 Calibratore urinario per Oppiacei 5 x 2 x 5 ml CC45017 Controllo urinario per Oppiacei Livello 1 6 x 5 ml CC45018 Controllo urinario per Oppiacei Livello 2 6 x 5 ml CC45019 Controllo urinario per Oppiacei Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml CC45116 Calibratore urinario per 6-Monoacetilmorfina 5 x 2 x 5 ml CC46116 Calibratore urinario per Cocaina 5 x 2 x 5 ml CC48116 Calibratore urinario per EDDP 5 x 2 x 5 ml CC48017 Controllo urinario per EDDP, 6-MAM e Cocaina Livello 1 6 x 5 ml CC48018 Controllo urinario per EDDP, 6-MAM e Cocaina Livello 2 6 x 5 ml CC48019 Controllo urinario per EDDP, 6-MAM e Cocaina Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml CC47016 Calibratore urinario per THC 5 x 2 x 10 ml CC47017 Controllo urinario per THC Livello 1 6 x 10 ml CC47018 Controllo urinario per THC Livello 2 6 x 10 ml CC47019 Controllo urinario per THC Livelli 1 e 2 2 x 6 x 10 ml S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 Pz ZTF Colonna analitica Accucore C 18 (30 x 2,1 mm. 2.6 um) 1 Pz 8

9 FRAMMENTAZIONI ANALITA PARENT ION Morfina Codeina Diidrocodeina MDA MDMA MDE BEG Cocaina MAM Metadone EDDP Amfetamina Metamfetamina Norbuprenorfina Etilmorfina Delta-9-THC-COOH Cocaetilene Efedrina Pseudoefedrina Norpseudoefedrina MBDB Buprenorfina Acido Mefenamico ,4-MDPA Atropina Normorfina Norcodeina Ossicodone Diacetilmorfina Ketamina

10 Fig. 1 : Campione urinario Fig. 2 : Campione urinario R.T delta-9-thc-cooh R.T Acido Mefenamico 10

11 Fig. 3 : Campione urinario Fig. 4 : Campione urinario R.T BENZOILECGONINA R.T COCAINA 11

12 Fig. 5 : Campione urinario Fig. 6 : Campione urinario R.T COCAETILENE R.T ATROPINA 12

13 Fig. 7 : Campione urinario Fig. 8 : Campione urinario R.T MDMA R.T MDA 13

14 Fig. 9 : Campione urinario Fig. 10 : Campione urinario R.T AMFETAMINA R.T METAMFETAMINA 14

15 Fig. 11 : Campione urinario Fig. 12 : Campione urinario R.T MDE R.T MDPA 15

16 Fig. 13 : Campione urinario Fig. 14 : Campione urinario R.T METADONE R.T EDDP 16

17 Fig. 15 : Campione urinario Fig. 16 : Campione urinario R.T NALORFINA R.T NORBUPRENORFINA 17

18 Fig. 17 : Campione urinario Fig. 18 : Campione urinario R.T BUPRENORFINA R.T MORFINA 18

19 Fig. 19 : Campione urinario Fig. 20 : Campione urinario R.T ETILMORFINA R.T DIIDROCODEINA 19

20 Fig. 21 : Campione urinario Fig. 22 : Campione urinario R.T CODEINA R.T MAM 20