OSSALATI URINARI in UV e/o in FLUORIMETRIA Codice Z32010
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- Dorotea Spinelli
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1 OSSALATI URINARI in UV e/o in FLUORIMETRIA Codice Z32010 BIOCHIMICA Gli ossalati introdotti con la dieta vengono per la maggior parte eliminati immodificati con le urine. Se nella dieta è contenuta una elevata quantità di calcio, la quantità di ossalato assorbita dall intestino tende a diminuire poiché l ossalato viene precipitato come ossalato di calcio; la iperossaluria è quindi facilmente riscontrabile nei soggetti a dieta ricca di ossalati e povera di calcio quale può essere una dieta vegetariana che favorisce infatti la formazione di calcoli di ossalato di calcio. Altre condizioni nelle quali si può verificare un elevato assorbimento intestinale di ossalati sono costituite dalle sindromi di malassorbimento e da resezioni dell intestino tenue. Esiste anche una forma di iperossaluria primitiva, rara alterazione congenita del metabolismo caratterizzata dalla eliminazione con le urine di una elevata quantità di ossalato di calcio con conseguente formazione di calcoli di ossalato di calcio e da gravi alterazioni renali (nefrocalcinosi). Oltre che nel rene si possono formare depositi di ossalato di calcio anche in vari tessuti (ossalosi). La malattia si manifesta nei primi anni di vita con coliche renali ed ematuria dovuta alla formazione di calcoli e di depositi di ossalato di calcio a livello renale. Col progredire delle alterazioni si manifestano i segni della insufficienza renale cronica ed il malato muore non di rado prima dei 20 anni con un quadro di uremia. Nei soggetti affetti da iperossaluria primitiva la quantità di ossalati urinari nelle 24 ore aumenta sensibilmente raggiungendo punte di mg/24 ore. Il presente metodo consente di analizzare quantitativamente in HPLC l Acido Ossalico presente nelle urine come Ossalato. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 011 Ossalati urinari in UV Febbraio
2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: L Acido Ossalico, presente nelle urine come Ossalato, viene precipitato selettivamente con due reagenti specifici. Dopo un lavaggio con due soluzioni diverse, l Ossalato viene riportato in soluzione e derivatizzato. La soluzione così ottenuta, diluita con lo stabilizzante, viene iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : > 93% Sensibilità del Metodo : Valori di riferimento : Range dinamico del metodo : Contenuto della confezione : Reagente A Soluzione Tampone, 1 x 100 ml Reagente B Soluzione Precipitante, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione di Lavaggio 1, 1 x 200 ml Reagente D Soluzione di Lavaggio 2, 1 x 200 ml 0,1 mg/l 3,0 30,0 mg/24 h 0,1 600 mg/l Tutti i reagenti sono pronti all'uso, eccetto il Reagente G Sol. di Derivatizzazione, e stabili 3 anni a 2-8 C. La presenza di corpo di fondo è normale. Agitare prima dell uso. La presenza di corpo di fondo è normale. Agitare prima dell uso. Reagente E Soluzione Estraente, 1 x 50 ml Reagente F Soluzione Stabilizzante, 1 x 50 ml Reagente G Soluzione di Derivatizzazione, 4 x 30 mg Ogni flacone va ricostituito con 5 ml di Reagente L - Solubilizzante Reagente H Standard Chimico, 1 x 10 ml Reagente I Soluzione Test Derivatizzata, 1 x 2 ml Reagente L Solubilizzante, 1 x 20 ml Reagente M Fase Mobile, 2 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl. Detector spettrofotometrico UV λ=320 nm Detector Fluorimetrico λ EX =320 nm λ EM =420 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo : Fase preanalitica : Raccolta urinaria delle 24 ore con aggiunta di 5 ml di HCl 2 N. Verificare che il campione abbia un ph circa uguale a 3; eventualmente correggerlo con HCl 2 M o NaOH 2 N Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Campione stabile 4 settimane a 2-8 C o 2 mesi a 20 C. 2
3 PROCEDURA PREANALITICA Diluizione 1:10 del Reagente I Soluzione Test Derivatizzata In una provetta pipettare: 0,9 ml di Reagente M Fase Mobile 0,1 ml di Reagente I Soluzione Test Derivatizzata NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 50 µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione dell Ossalato che deve essere simile a quello riportato in fig.1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questo Test così ottenuto non deve essere usato come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Ricostituzione del Reagente G Sol. di Derivatizzazione Aggiungere al flacone contenente il Reagente G in polvere 5 ml di Reagente L - Solubilizzante. Una volta ricostituito il Reagente G è stabile circa 2 mesi a 2 8 C a riparo dalla luce. FASE 2 : Preparazione dello Standard Chimico In una provetta da 10 ml pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente H - Standard Chimico Si otterrà una Soluzione Standard contenente 20 mg/l FASE 3 : In provette di plastica da centrifuga da 10 ml dispensare in sequenza: Standard Campione Campione 1,00 ml Soluzione Standard 20 mg/l 1,00 ml Reagente A Soluzione Tampone 1,00 ml 1,00 ml Reagente B Soluzione Precipitante 1,00 ml 1,00 ml Al vortex per 20 secondi Centrifugare a rpm per 2 minuti Aspirare e gettare tutto il surnatante FASE 4 : Lavare il precipitato aggiungendo in sequenza: 2 ml di Reagente C Sol.di Lavaggio 1 2 ml di Reagente D Sol.di Lavaggio 2 Al vortex per 20 secondi Centrifugare a rpm per 2 minuti Aspirare e gettare tutto il surnatante Release N 011 Ossalati urinari in UV Febbraio
4 FASE 5 : Aggiungere al precipitato 0,5 ml di Reagente E Sol. Estraente 0,5 ml di Reagente F Sol. Stabilizzante Al vortex fino a quando tutto il precipitato non si è solubilizzato FASE 6 : Trasferire tutto il contenuto in provette di vetro da 10 ml con tappo a vite e setto in teflon ed aggiungere 0,2 ml di Reagente G Sol. di Derivatizzazione Al vortex per 10 secondi FASE 7 : Porre in stufa a 120 C per 16 ore e Raffreddare FASE 8 : Diluire il derivatizzato 1:40 con Acqua grado HPLC N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 011 Ossalati urinari in UV Febbraio
5 REAGENTE H : STANDARD CHIMICO OSSALATI URINARI Avvertenze Acido Ossalico 200 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 320 nm 0,001 AUFS 10 secondi PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ EX λ EM GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 320 nm 420 nm MEDIUM 5 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile ( 20:80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da 0,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di (80:20v/v) Acetonitrile:Acqua per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 90 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z32020 Standard Chimico per Ossalati 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 5
6 OSSALATI URINARI ( Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 1 : Standard Chimico Fig. 2 : Standard Chimico diluito R.T Ossalato 45,5 mg/l R.T Ossalato 20,55 mg/l 6
7 OSSALATI URINARI ( Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 : Standard Chimico diluito Fig. 4 : Campione di urina R.T Ossalato 60,17 mg/l R.T Ossalato 25,41 mg/l 7
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