TIOPENTALE SIERICO e/o PLASMATICO IN UV Codice Z02010

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Vito Giuseppe Serafini
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1 TIOPENTALE SIERICO e/o PLASMATICO IN UV Codice Z02010 BIOCHIMICA Il tiopentone o 5-Ethlyl-5-(1- methylbutyl)-2- thiobarbituric acid, di peso molecolare 242,3, appartiene alla classe dei barbiturici solforati a breve emivita (ca. 9 ore in dose singola) ed è usato, mediante somministrazione endovenosa, per l'induzione dell anestesia generale. A concentrazioni plasmatiche superiori a 20 mg/l induce coma. Poiché possiede un indice di liposolubilità elevatissimo (580 contro 3 del Fenobarbital) il Tiopentone, in terapie protratte, tende ad accumularsi nell'organismo e la sua emivita può superare le 96 ore determinando aumenti considerevoli delle concentrazioni plasmatiche che, in dose singola sono comprese nel range 8-12 mg/l mentre per terapie a lungo termine sono descritte in letteratura concentrazioni letali nel range mg/l. (1) Oltre che come induzione, viene usato anche in terapia di rianimazione a medio e lungo termine per produrre sedazione in pazienti con traumi cranici importanti. PATOLOGIA A causa dell'elevato indice di liposolubilità nelle terapie protratte, le concentrazioni plasmatiche tendono ad aumentare in forma non proporzionale rispetto alle dosi somministrate; occorre quindi monitorare con continuità le concentrazioni plasmatiche del farmaco. (1) S.D.FERRARA - Il Laboratorio di Farmacologia e Tossicologia clinica. Ed. Medico Scientifiche- Torino EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 013 Tiopentale sierico/plasmatico in UV Dicembre

2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Il Tiopentone o tiopentale viene isolato trattando il siero/plasma con un opportuno precipitante. Dopo aggiunta di uno stabilizzante l'estratto viene direttamente iniettato in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : 0,2 µg/ml Range dinamico del metodo : 0,2-500 µg/ml Range terapeutico nel siero : µg/ml Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2-8 C. Reagente A - Soluzione deproteinizzante con Standard Interno, 1 x 50 ml Reagente B - Soluzione stabilizzante, 1 x 50 ml Reagente C - Soluzione Test/Standard chimico, 1 x 5 ml Reagente M - Fase mobile, 2 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl Detector spettrofotometrico UV λ = 280 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità per il prelievo ematico : Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta senza gel e con eparina. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il siero e stoccarlo a 2 8 C. Stabile 2 settimane. Stabile 4 mesi a 20 C. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA Pipettare in provetta : 400 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente C Sol. Test Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig.1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dello Standard di Calibrazione In una provetta pipettare : 200 µl di H 2 O di grado HPLC 200 µl di Reagente C - Standard chimico Si otterrà una soluzione standard di calibrazione a 25 µg/ml FASE 2 : Preparazione dei campioni Dispensare in provette da centrifuga idonee : Bianco Standard di Calibrazione Campione Acqua di grado HPLC 200 µl Standard di Calibrazione 200 µl Campione 200 µl Reagente A Sol. deproteinizzante 400 µl 400 µl 400 µl Attenzione: si consiglia di deproteinizzare direttamente sul Vortex per almeno 10 secondi FASE 3 : Aggiungere 400 µl di Reagente B Sol. stabilizzante FASE 4 : Centrifugare a 5000 rpm per 5 minuti. Al vortex per 10 secondi FASE 5 : Trasferire 500 µl di sovranatante limpido in un altra provetta. INIEZIONE : N.B.: il campione così preparato è stabile 7 giorni a 2-8 C Iniettare 50 µl del sovranatante nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 013 Tiopentale sierico/plasmatico in UV Dicembre

4 TIOPENTALE - Avvertenze REAGENTE C : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST TIOPENTALE 50 µg/ml PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ SENSIBILITA STRUMENTALE TEMPO DI INTEGRAZIONE 280 nm 0.01 AUFS 5 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ o 0,45 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da 0,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 130 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z02020 Standard Chimico per Tiopentale 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C18 (4,6 x 150 mm, 4 µ) 1 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 PZ 4

5 TIOPENTALE SIERICO e/o PLASMATICO in UV (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 1 Soluzione Test Fig. 2 Standard di Calibrazione R.T Tiopentale R.T Standard Interno R.T Tiopentale 25 µg/ml 5

6 TIOPENTALE SIERICO e/o PLASMATICO in UV (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 3 Campione plasmatico Fig. 4 Campione plasmatico R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T Tiopentale 10 µg/ml R.T Tiopentale 2.5 µg/ml 6

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