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1 Determinazione di sostanze amfetamino-simili in matrici biologiche convenzionali e non convenzionali in HS-SPME e GC-MS Scheda tecnica a cura di: Stefano Gentili Il reparto Sostanze d Abuso ha messo a punto una procedura di microestrazione in fase solida in spazio di testa (HS-SPME) associata alla gas cromatografia e spettrometria di massa (GC-MS) che permette la rilevazione simultanea di MDA, MDMA, MDE, MBDB, Amfetamina, metamfetamina, ketamina, efedrina, nicotina, fenciclidina, metadone in matrici biologiche convenzionali (urina, siero, plasma) e non convenzionali (capelli, saliva), nonché minerali (reperti del traffico illecito). La procedura è semplice, veloce, riproducibile, richiede una minima quantità di campione, riduce al massimo il trattamento del campione stesso e non necessita di derivatizzazione. Il metodo garantisce una buona sensibilità: ad esempio, il limite di rilevabilità (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) per ciascuna sostanza risultano, nel caso dei capelli, inferiori a 0,7 e 1,9 ng/mg rispettivamente. La precisione intra-saggio è tra il 2 e il 10%. Il metodo risulta idoneo per la routine clinica, per scopi epidemiologici e forensi. 1

2 Preparazione del campione [Capelli] Lavare i capelli per 5 minuti in acqua deionizzata e successivamente per 5 minuti in acetone in un bagno a ultrasuoni. I capelli lavati vengono poi asciugati sotto flusso di azoto a temperatura ambiente e tagliati in segmenti di 3 millimetri circa. [Saliva, siero, plasma] Non è necessario pre-trattamento [Polveri] Sciogliere 2 mg di campione in 1 ml di HCl 0.4 M (soluzione A) [Compresse] Grattare via dalla parte esterna ed interna della compressa 2 mg di campione da sciogliere in 1 ml di HCL 0.4 M (soluzione A) Materiali e apparecchiature MDA, MDMA, MDE, MBDB, A, MA cloridrato 1 m/ml in alcol metilico (Sigma Aldrich, Milano, Italia); 3,4 methylen-dioxypropylamphetamina (MDPA) cloridrato 1 mg/ml in alcol metilico, efedrina, fenciclidina, metadone e nicotina (SALARS, Como, Italia). Ketamina come Ketavet 50 (Farmaceutici Gellini S.p.A., Aprilia, Italia); Acido cloridrico, idrossido di sodio e acetone (Carlo Erba - Milano, Italia). Provette per lo spazio di testa da 20 ml con tappi in teflon a chiusura ermetica (C.P.S. analitica, Milano, Italia). Bagno a ultrasuoni T 310 (Carlo Erba - Milano, Italia). Dispositivo per la raccolta del fluido orale (Cozart Bioscience Ltd (Oxfordshire, U.K.). Siringa manuale e fibra di estrazione 100 µm polydimethylsiloxane (PDMS) codice del prodotto (57330-U). Liner 0,75 mm ID, (codice del prodotto ,05). blocco riscaldante 110 VAC (Sigma Aldrich, Milano, Italia). 2

3 Procedura analitica Capelli 50 mg di capelli lavati, 50 µl di Standard Interno (MDPA 10 µg/ml corrispondenti a 10 ng/mg di capelli) e 950 µl di idrossido di sodio 30% (NaOH 30%) sono posti in una provetta di vetro da 20 ml a chiusura ermetica con tappo in teflon. Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 3

4 Saliva, siero, plasma 50 µl di campione, 50 µl di Standard Interno (MDPA 10 µg /ml) e 900 µl NaOH 30% sono posti in una provetta di vetro da 20 ml a chiusura ermetica con tappo in teflon. Polvere e compresse 100 µl della Soluzione A, 50 µl di Standard Interno (MDPA 10 µg/ml) e 850 µl NaOH 30% sono posti in una provetta di vetro da 20 ml a chiusura ermetica con tappo in teflon. Una volta chiusa, la provetta viene scaldata per 20 minuti a 70ºC. Successivamente, i composti che raggiungono l equilibrio nello spazio di testa, vengono adsorbiti inserendo la siringa all interno della provetta ed esponendo la fibra per 5 minuti a 70ºC. Figura 5 Figura 6 4

5 La parte rimanente di Soluzione A viene opportunamente conservata (in più aliquote per le eventuali analisi di conferma). Parametri della gas cromatografia spettrometria di massa È stato usato un Gas Cromatografo 6890 Plus, e un Mass Selective Detector 5973N (Agilent Technologies, Milano, Italia), equipaggiato con una colonna di 30 m x 0.25 mm HP-5 (5% PH ME Siloxane, film thickness 0.25 µm). Figura 7 Temperatura della colonna 60ºC (2 minuti isoterma) fino a 250ºC (incremento 20ºC/min) e 5 minuti isoterma finale. Temperatura della porta d iniezione 250ºC Temperatura della sorgente ionica 230ºC Temperatura della linea di trasferimento 280ºC Flusso gas (elio) Desorbimento della fibra 0.7 ml/min 250ºC per 3 minuti nell iniettore 5

6 I composti vengono identificati in base al loro tempo di ritenzione (Rt) e a tre ioni per ciascuna sostanza (Tabella 1). Figura 8 Fonte: Stefano Gentili, Alessio Torresi, Remo Marsili, Marcello Chiarotti, Teodora Macchia Simultaneous detection of amphetamine-like drugs with headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 780 (2002)

7 Tabella 1. Elenco delle sostanze identificate con la procedura HS-SPME GC/MS Sostanze Tempi di ritenzione Ioni Amfetamina (A) , 91, 65 Metilamfetamina (MA) , 91, 77 Nicotina , 133, 161 Efedrina , 77, 105 Metilendiossiamfetamina (MDA) , 136, 135 Metilendiosimetilamfetamina (MDMA) , 77, 135 Metilediossietilamfetamina (MDE) , 44, 135 Metilenbenzodiozolbutanamina (MBDB) , 44, 135 Metilendiossipropilamfetamina (MDPA)* , 44, 135 Ketamina , 182, 209 Fenciclidina , 242, 243 Metadone , 91, 223 * Standard Interno 7

8 Figura 1. Cromatogramma a scansione completa in HS-SPME GC/MS di una soluzione acquosa arricchita con 100 µl /ml di A, MA, Nicotina, Efedrina, MDA, MDMA, MDE, MBDB, Ketamina, Fenciclidina e Metadone Abundance Figura 9 2 TIC: [BSB1]06.D 1 A 2 MA 3 Nicotina 4 Efedrina 5 MDA 6 MDMA 7 MDE 8 MBDB 9 Ketamina 10 Fenciclidina 11 Metadone Time-->

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