AFFIDABILITA DEI METODI DI RILEVAZIONE:RUOLO DEL LABORATORIO NELL INDAGINE TOSSICOLOGICA

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1 AFFIDABILITA DEI METODI DI RILEVAZIONE:RUOLO DEL LABORATORIO NELL INDAGINE TOSSICOLOGICA Valeria Crespi, Ursula Andreotta Laboratorio di Tossicologia UO Medicina del Lavoro e Preventiva AO Ospedale di Circolo e Fondazione Macchi-Varese

2 PREMESSA L intesa tra il Governo, le Regioni e gli Enti Locali, che la Conferenza Unificata ha raggiunto il 30 giugno 2007, rendendo obbligatorio da parte del datore di lavoro, l accertamento di assenza di assunzione, anche solo sporadica, di sostanze stupefacenti, sui lavoratori le cui mansioni comportano rischi per la sicurezza, l incolumità e la salute propria e di terzi, ha posto l attenzione sul ruolo centrale svolto dai laboratori di tossicologia nel fornire al medico competente un dato analitico certo.

3 PREMESSA Uno dei principi fondamentali negli accertamenti di assenza di tossicodipendenza è l affidabilità degli accertamenti a garanzia delle parti, per evitare giudizi errati che porterebbero a conseguenze gravi per il lavoratore, dal momento che lo stesso, verrebbe sospeso immediatamente dalla mansione svolta fino a quel momento, in caso di esito positivo.

4 TIPOLOGIA D ANALISI Le analisi per la ricerca delle sostanze stupefacenti si dividono in: Analisi di screening Analisi preliminari eseguite con tecniche immunochimiche, in cui sensibilità e specificità sono in funzione dell anticorpo utilizzato (monoclonale o policlonale). Sono tecniche dotate di caratteristiche quali elevata sensibilità, velocità di analisi, non necessità di pretrattamento del campione, possibilità di automazione. Se da una parte, le elevate sensibilità escludono o riducono fortemente l eventualità di falsi negativi, dall altra l evenienza di falsi positivi è verosimile, soprattutto per il principio su cui si basano questi metodi, cioè una reazione antigene-anticorpo che presenta spesso una specificità di gruppo.

5 TIPOLOGIA D ANALISI A causa, quindi, di queste possibili cross-reazioni, i risultati positivi necessitano di una conferma, mediante metodi diversi, altamente specifici, con limiti di rilevabilità generalmente inferiori al valore del cut-off utilizzato nello screening: tali caratteristiche sono proprie dei metodi cromatografici.

6 TIPOLOGIA D ANALISI Analisi di conferma Vengono utilizzate per confermare un dato preliminare, proveniente dalle analisi di screening. Eseguite da laboratori specializzati, dotati di strumentazione adeguata, servono a escludere che non ci siano falsi positivi ai test iniziali a causa della loro non specificità. Caratteristiche dei test di conferma: sensibilità al valore soglia (cut-off) dei test di screening, specificità elevata per i singoli analiti. Vengono utilizzate tecniche cromatografiche tra cui la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/MS) è la tecnica di elezione raccomandata dalle Società Scientifiche Internazionali

7 Sostanze più comunemente ricercate Classi di sostanze Cut-off o valore soglia test immunochimici Sensibilità analitica test immunochimici Semiquantitativi (strumentali) Sensibilità analitica /cut-off test immunochimici Qualitativi (on site) OPPIACEI 300ng/mL 100 ng/ml 300ng/mL COCAINA 300 ng/ml 100 ng/ml 300 ng/ml CANNABINOIDI 50 ng/ml 25 ng/ml 50 ng/ml AMFETAMINE 500 ng/ml 250 ng/ml 1000 ng/ml METOSSIAMF. 300 ng/ml 150 ng/ml 500 ng/ml METADONE 300 ng/ml 100 ng/ml 300 ng/ml BUPRENORFINA 5 ng/ml 3ng/ml 10 ng/ml

8 Analisi di screening: esempi di farmaci interferenti nei dosaggi immunochimici dosaggio Farmaci interferenti oppiacei Amfetamine/metos siamfetamine Ofloxacina, rifampicina (non oppiacei), farmaci oppioidi:diidrocodeina,codeina. Efedrina,fenfluramina,fenilpropanolamina, fentermina, pseudoefedrina, clorpromazina, selegilina

9 Matrici biologiche In funzione delle caratteristiche farmacocinetiche delle sostanze, una droga o i suoi metaboliti possono essere rilevati nelle varie matrici in tempi differenti urina giorni sangue ore saliva ore capelli mesi

10 Matrici biologiche Urina Materiale biologico di prima scelta, presenta diversi vantaggi: 1. Prelievo non invasivo 2. Possibilità di campionare grandi volumi 3. Possibilità di ritrovare i metaboliti delle sostanze d abuso anche dopo alcuni giorni svantaggi: 1. Scarsa rilevanza clinica dell analisi quantitativa poiché le concentrazioni variano con: dose, via di assunzione, tempo di latenza, stato fisiologico del soggetto 2. Possibilità di adulterazione

11 Matrici biologiche Sangue matrice utilizzata a fini legali ( incidenti stradali, morti violente in genere) svantaggi: 1. prelievo invasivo ( occorre il consenso) 2. tempo di rilevabilità: poche ore

12 Matrici biologiche Saliva matrice paragonabile al sangue, utilizzata nelle indagini preliminari dalle Forze dell Ordine. vantaggi: 1. prelievo non invasivo 2. Rischio ridotto di adulterazione svantaggi: 1. difficoltà a reperire una quantità di materiale sufficiente per le analisi sia di screening che di conferma; 2. il passaggio della droga e dei suoi metaboliti dal sangue alla saliva dipende da numerosi fattori comprendenti la natura chimica della droga, il ph della saliva (droghe basiche come amfetamine e cocaina si ritrovano in concentrazioni più elevate rispetto al plasma), dalla quota di droga legata alle proteine (solo la quota libera può diffondere); 3. la raccolta del materiale con dispositivi assorbenti, potrebbe portare ad un rapporto droga parente/metaboliti più basso rispetto al fluido orale tal quale; 4. la possibile adulterazione del fluido così come la possibile esposizione passiva a droghe Cone E. J. and Huestis M.A.Interpretation of oral fluid tests for drugs of abuse.ann.n.y.acad.sci.1098:51-103(2007):

13 Matrici biologiche Capelli La matrice cheratinica consente di valutare la situazione pregressa di assunzione di sostanze stupefacenti. In linea generale, le sostanze vengono incorporate nella matrice cheratinica attraverso lo scambio tra il sangue circolante e le cellule del bulbo pilifero. Una volta fissate nella parte prossimale del capello, esse vengono rese rilevabili man mano che il capello cresce superando il cuoio capelluto ad una velocità media di cm/mese con una variabilità legata al singolo soggetto.

14 INTERPRETAZIONE Le sostanze d abuso e i loro metaboliti si presentano nelle varie matrici biologiche in rapporti differenti e in tempi differenti. E necessario pertanto conoscere il metabolismo, la farmacocinetica e la farmacodinamica delle varie droghe per poter interpretare correttamente il dato analitico.

15 METABOLISMO DELL EROINA ( Sangue) EROINA ( 3,6-Diacetilmorfina ) 1 deacetilazione (tutti i tessuti) 6-Monoacetilmorfina ( 6-MAM) (t1/2 = 9 20 minuti) 2 deacetilazione ( tutti i tessuti) Morfina _ ( Urina ) Morfina libera ( circa 10% ) e coniugata con acido glucuronico ( circa 90% )

16 Farmacocinetica e farmacodinamica sostanza eroina cocaina cannabinoidi Amfetamine/metossiamfetamine giorni di rilevabilità nelle urine del metabolita principale 2-4 gg morfina 2-5 gg benzoilecgonina 5-6 gg -9-THCCOOH (consumatori occasionali) fino a 40 gg -9-THCCOOH (consumatori cronici) 2-3 gg amfetamina, metamfetamina,mdma

17 Farmacocinetica e farmacodinamica sostanza rilevabilità nel sangue t1/2 eroina cocaina cannabinoidi 3-4 eroina MAM 3-4h morfina h cocaina 5-7h benzoilecgonina 0.75h THC 5-6ggTHCCOOH Amfetamine/metossiamfetamine 7-10h amfetamina,metamfetamina 8-9h MDMA

18 DISPOSITIVI DI SCREENING ON-SITE La scelta di un dispositivo on-site non può prescindere da alcuni criteri di valutazione che sono: 1. Finalità di utilizzo 2. Caratteristiche di sensibilità e specificità 3. Possibilità di un controllo interno 4. Prevalenza dell uso di sostanze nel territorio 5. Personale da cui è adoperato 6. Praticabilità

19 DISPOSITIVI DI SCREENING ON-SITE Un esempio di come possano variare le caratteristiche di sensibilità e specificità in relazione alla prevalenza dell uso della sostanza si può rilevare da un lavoro di Kadehjian del 2001(L.J.Kadehjian,2001 performnce of five noninstrument urine drug-testing devices with challenging near-cutoff specimens J.Anal.Toxicol.25: ) in cui sono state valutate le performance di quattro dispositivi on-site applicati a campioni intorno al cut-off. Pur fornendo nel complesso livelli di performance accettabili,analizzando ciascun dispositivo per le diverse classi di sostanze, si rilevano chiari deficit in termini di sensibilità e specificità, in particolare per amfetamine e cannabinoidi.

20 PRESTAZIONI INTORNO AL CUT-OFF

21 Il laboratorio nell indagine tossicologica L analisi delle sostanze stupefacenti nelle varie matrici biologiche, per la complessità di approccio analitico, è propria di laboratori specialistici, dove, a partire da un iniziale autorizzazione regionale concessa a fronte di specifiche caratteristiche strutturali,tecnologiche, organizzative e professionali, si sono sviluppate nel tempo, procedure atte ad un miglioramento continuo della qualità al di là del tradizionale concetto del controllo di qualità interno ed esterno.

22 Il laboratorio nell indagine tossicologica I settori di intervento di un laboratorio di Tossicologia (autorizzato secondo le normative regionali vigenti) sono: analisi finalizzate alla diagnosi e al trattamento dei tossicodipendenti afferenti alle strutture pubbliche o private. analisi per scopi amministrativi e/o medico-legali richieste da: 1. Commissioni Mediche Locali patenti di Guida 2. Prefettura:verifica trattamenti alternativi alle sanzioni previste dal DPR 309/90 3. Enti pubblici e/o privati: accertamenti sui lavoratori le cui mansioni comportano rischi per la sicurezza, l incolumità e la salute di terzi ( art.125 DPR 285/92)

23 Il laboratorio nell indagine tossicologica 1. Forze dellordine: accertamento stato di ebbrezza o assunzione sostanze stupefacenti alla guida 2. Determinazione dei requisiti psico-fisici per il rilascio del porto d armi (GU 304/91)

24 Il laboratorio nell indagine tossicologica La struttura organizzativa di un laboratorio di tossicologia deve prevedere: accesso alla struttura controllato; procedure di: raccolta del materiale biologico in locali idonei, tali da assicurare l identità, l integrità e l autenticità dei campioni, pur garantendo il riserbo individuale; suddivisione, alla presenza del soggetto, dei campioni in aliquote, ciascuna sigillata e recante i dati del soggetto, data del prelievo, firma del donatore e di chi ha effettuato il prelievo, per un eventuale revisione d analisi; conservazione delle aliquote a -20 C, per un periodo di tempo da tre mesi a un anno, salvo disposizioni della Magistratura

25 Il laboratorio nell indagine tossicologica verifica dell idoneità dei campioni di matrice urinaria con controllo di alcuni parametri chimico -fisici e con il dosaggio della creatinina urinaria; catena di custodia: documentazione che accompagna il campione e che riporta le notizie sul prelievo,trasporto e conservazione; partecipazione a programmi di VEQ nazionali e internazionali; modalità di refertazione ( indicazioni sui metodi utilizzati, sul campionamento, sulla conservazione delle aliquote, sulle singole sostanze ritrovate e sul loro significato); Adesione alle linee guida nazionali e internazionali i ambito tossicologico.

26 Analisi della % di campioni di urina giudicati non idonei tramite il dosaggio della creatinina urinaria, nel Test creatinina urinaria di campioni effettuati nel % 98% >20 mg/dl <20 mg/dl

27 CQI OPPIO regola n 1 di Westgard

28 CQI OPPIO regola n 2 di Westgard

29 CQI OPPIO regola n 3 di Westgard

30 CQI OPPIO regola n 4 di Westgard

31 CQI OPPIO regola n 5 di Westgard